基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用,所述荧光对为Cerulean3与Venus，本发明专利技术还提供一种包含所述荧光对的探针，所述探针可用于检测活细胞内CaMKII的活性，研究活细胞中CaMKII活性的精确时空调控。研究活细胞中CaMKII活性的精确时空调控。研究活细胞中CaMKII活性的精确时空调控。

【技术实现步骤摘要】
基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学及分子生物学领域，具体涉及一种基于FRET效应的荧光对、包含其的探针及应用。

技术介绍

[0002]CaMKII是钙/钙调蛋白(Ca
2+
/CaM)依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过感知Ca
2+
信号在细胞信号传递中发挥重要作用。除了约30个剪接变体外，还有四种CaMKII同工酶(a、b、c和d)在人类中表达。a和b亚型是大脑特有的，c和d亚型在大多数组织中都有表达，在心脏组织表达更多。有研究表明，CaMKII在学习记忆、突触形成、心血管疾病等均发挥重要作用，因此研究活细胞中CaMKII活性的精准时空调控有重要意义。目前常采用基于FRET原理的CAMUI作为传感器探测活细胞内CaMKII活性，传统CAMUI采用经典荧光蛋白对，包括青色荧光蛋白/黄色荧光蛋白(CFP/YFP)作为荧光对。。
[0003]传统CAMUI设计缺点有：CFP与YFP的荧光量子产率不高且两者的pH敏感性较高；CFP有强烈的荧光开关现象，影响FRET比率；常用氯化钙为钙离子来源时，YFP对氯离子(Cl
‑
)敏感，会被氯离子(Cl
‑
)猝灭。以上缺陷造成CFP/YFP无法用于活细胞中CaMKII活性的精准时空调控研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种Cerulean3/Venus作为荧光对，取代CFP/YFP，并设计新的CAMUI代替传统CAMUI。Venus作为YFP的变体，折叠良好，对酸性环境和氯离子暴露相对耐受，采用氯化钙试剂检测活细胞时可以减少氯离子对荧光的影响。Cerulean3作为CFP的变体为更加明亮，具有单一荧光指数的蛋白，相比于CFP，Cerulea3的荧光量子产率更高，且荧光开关行为显著降低，光更稳定。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种基于FRET效应的荧光对,所述荧光对为Cerulean3与Venus。
[0006]一种包含上述荧光对的探针，它的结构为mVenus
‑
CaMKIIδ
‑
mCerulean3,见图1。本专利技术CAMUI结构，与传统CAMUI结构相比，将CFP替换为mVenus，将YFP替换为mCerulean3。CAMUI结构是mCerulean3连接于CaMKIIδ的C端,mVenus连接于CaMKIIδ的N端，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
[0007]一种所述探针的应用，所述探针用于检测活细胞内CaMKII的活性。检测机理如图2所示：钙离子/钙调蛋白(Ca
2+
/CaM)结合在CaMKII的调节区域(regulatory)，激酶区域（catalytic）与调节区域分开从而CaMKII构象改变，增加mCerulean与mVenus的距离，使得两荧光蛋白间的FRET降低。
[0008]一种所述探针的制备方法，该方法为行业内成熟的基因重组方法，具体为以人CaMKIIδ基因为目的基因，在其CDS前后添加酶切位点，然后重组在mCerulean3（SEQID NO.2）与mVenus（SEQID NO.3）两种荧光蛋白基因序列之间，从而产生mVenus
‑
CaMKIIδ
‑
mCerulean3的融合体，融合体的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。将融合体序列片段克隆在质粒载体上形成重组质粒，将重组质粒转入感受态细菌进行克隆复制，对得到的质粒提纯并对该融合基因进行测序和序列分析；将提纯后的质粒转染宿主细胞表达得到所述探针。
[0009]作为技术方案的进一步改进，所述质粒载体为pCMV
‑
Blank载体。
[0010]本专利技术相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本专利技术的荧光对相比于原有的经典蛋白对CFP/YFP，荧光量子产率高且两者的pH敏感性低，FRET比率稳定，对氯离子(Cl
‑
)敏感性降低。进一步说，本专利技术的探针可用于活细胞中CaMKII活性的精准时空调控检测和研究。再一步说，本专利技术的探针采用常规的基因重组方法制备，操作简单，价格低廉。
附图说明
[0011]图1为传统及本专利技术的CAMUI结构示意图。
[0012]图2为本专利技术CAMUI检测活细胞内CaMKII活性原理图。
[0013]图3为转染细胞在430nm激发光波长下的发射光谱图。
[0014]图4为转染细胞FRET图谱变化图。
具体实施方式
[0015]下面通过具体实施方式，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
[0016]本公开中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0017]实施例1检测药物刺激下活细胞内CaMKII活性变化细胞培养：96孔板内每孔加104个HEK293T细胞，用含有10%体积比FBS的DMEM培养12小时，在转染前更换为无血清DMEM培养1小时。
[0018]转染步骤：准备两组1.5ml离心管，每管加50μL无血清DMEM，其中一组加构建的质粒pmVenus
‑
CaMKIIδ
‑
mCerulean3，使用移液枪轻轻吹打5下待用，另一组加GenJet
™
体外DNA转染试剂，使用移液枪轻轻吹打5下，静置5min，所需转染质粒与转染试剂的比例为1μg:2.5μL。静置5min后，将含有pmVenus
‑
CaMKIIδ
‑
mCerulean3构建质粒的DMEM混合液的一组转移至含转染试剂的DMEM混合液的一组中，使用移液枪轻轻吹打5下，混匀静置15min，将96孔细胞培养板从细胞孵育箱中取出，每孔加10μL混合液，加10个孔，每孔所含构建质粒为100ng，以上步骤需要全程避光。加入后将96孔细胞板重新放入细胞孵育箱中培养18小时后，更换完全培养基再继续培养18小时待用。重组质粒pmVenus
‑
CaMKIIδ
‑
mCerulean3采用碧云天生物技术有限公司的CMV
‑
Blank载体，重组步骤包括制备线性化载体（酶切或PCR）；扩增带同源臂的目的片段；载体、片段和2
×
GenRecMasterMix（2
×
GenRec试剂盒）混匀，50℃反应15
‑
30min；转化涂平板。其中主要步骤包括重组反应，转化和克隆鉴定，操作步骤如下：（1）重组反应:在冰上解冻2
×
GenRecMasterMix，颠倒混匀；在无菌管中加入载体和片段，其中片段添加量（ng）=0.02
×
片段碱基对数（bp）（对应的片段浓度为0.03pmol），用无菌水补足到10μL，最后加入10μL2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于FRET效应的荧光对,其特征在于，所述荧光对为Cerulean3与Venus。2.一种包含权利要求1所述荧光对的探针，其特征在于，它的结构为Venus
‑
CaMKII
‑
Cerulean3,Cerulean3连接于CaMKII的C端,Venus连接于CaMKII的N端，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。3.一种根据权利要求2所述探针的应用，其特征在于，所述探针用于检测活细胞内CaMKII的活性。4.一种根据权利要求2所述探针的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑秋凌，郝海平，吕志文，郑啸，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：