烟酰胺核糖激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一系列烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，所述烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。本发明专利技术所述的烟酰胺核糖激酶突变体可高效催化底物烟酰胺核糖(NR)在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸(NMN)，且能明显减少反应时间和酶的用量，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。具有较好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
烟酰胺核糖激酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于微生物基因技术重组领域，具体涉及的是一种表达烟酰胺核糖激酶(NRK)的重组菌的及其制备方法和实际应用。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种天然存在于人体中的物质，它直接参与细胞内NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成。NAD+作为一种存在于所有活细胞中的辅酶，能控制细胞功能和存活，以应对环境的变化，如营养摄入、细胞损伤等。随着年龄的增长，人体内自身含有的NAD+水平不断下降，使细胞线粒体活性降低；同时，NAD+减少也损害了细胞产生能量的能力，导致老化及老年相关疾病的发生。因此，NMN作为NAD+的前体，具备直接从根本上抗衰老的作用。鉴于此项，NMN项目目前已成为全球各医药及食品公司竞相研发的对象。
[0003]目前，国内生产NMN的主要方法有两种：化学合成法和生物酶催化法。其中化学合成法为直接的NMN合成工艺，方法为烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，而化学法合成磷酸化杂质较多，生产效率低，产品纯度低，且使用的大量有机溶剂对环境会造成一定程度的污染。
[0004]NMN的生物酶催化法主要是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在ATP存在的条件下，由烟酰胺核糖激酶(NRK)催化生成NMN，该途径所需反应步骤少，收率高，是目前NMN生产主流方案，但是现用烟酰胺核糖激酶(NRK)酶活较低，导致其应用于生产转化率较低。因此，开发酶活更高的烟酰胺核糖激酶具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有NMN生物酶催化过程中，产出烟酰胺核糖激酶的菌株酶活普遍不高的问题，本专利技术通过构建了烟酰胺核糖激酶突变体编码基因，重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体作为酶源，应用于烟酰胺单核苷酸(NMN)的生产，提高了生产效率。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下措施达到：
[0007]本专利技术提供一系列烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
[0008]本专利技术所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸残基的突变位点主要为突变体1的108D缺失，突变体2：S161T，突变体3：E123L D143E，突变体4：L65F N90I。
[0009]本专利技术还提供本专利技术所述的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因，在一些实施例中，所述基因如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
[0010]本专利技术还提供包含本专利技术所述的编码基因的重组载体。本专利技术所述的重组载体，可以按照本领域的常规方法将本专利技术所述的编码基因与常用表达质粒进行重组获得，例如，在一种实施例中，是将质粒pET
‑
28a用BamHI和HindIII双酶酶切，与编码基因用T4 DNA ligase连接获得。
[0011]本专利技术还提供包含本专利技术所述的编码基因或重组载体的感受态细胞。具体可以采
用本领域常用的感受态细胞按照本领域常规的方法将本专利技术所述的编码基因或重组载体转入获得，例如，以热激转化法将重组载体转入BL21(DE3)感受态细胞中获得。
[0012]本专利技术还提供本专利技术所述的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因、重组载体或感受态细胞在烟酰胺单核苷酸制备中的应用。本专利技术所述的应用，是以烟酰胺核糖(NR)为底物，在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸。
[0013]本专利技术具体应用的方式和条件可以按照本领域的常规方法，例如：
[0014]在一些实施例中，本专利技术所述应用的反应体系为：100～180mol/L的烟酰胺核糖、100～150mol/L的ATP
‑
2Na、1～5g/L的氯化镁，PBS缓冲液配置，pH为6.5～7.5。
[0015]在一些实施例中，本专利技术所述应用，如果使用烟酰胺核糖激酶突变体，则反应浓度为10～20U/ml；如果使用菌体，则菌体用量为20～30g/L。
[0016]在一些实施例中，本专利技术所述应用，反应时的温度为25～30℃。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018](1)本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶突变体蛋白，可高效催化底物烟酰胺核糖(NR)在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸(NMN)。
[0019](2)本专利技术提供的烟酰胺核糖激酶突变体蛋白，能明显减少反应时间和酶的用量，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。
具体实施方式
[0020]以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0021]若无特别说明，以下实施例中的“NR”表示烟酰胺核糖，“NMN”表示β
‑
烟酰胺单核苷酸。
[0022]实施例1筛选酶活高的重组菌
[0023]以野生烟酰胺核糖激酶的大肠杆菌基因组(SEQ ID NO.1)作为模板，采用易错PCR法构建基因随机突变质粒文库，具体PCR扩增体系和PCR程序如表1所示：
[0024]表1PCR扩增体系和PCR程序
[0025][0026]将上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA产物，将pET
‑
28a空载体用BamHI和HindIII双酶酶切，上述回收的DNA产物用同样方法酶切，将酶切后的DNA片段和pET
‑
28a载体用T4 DNA ligase连接，16℃反应过夜。
[0027]以热激转化法将质粒文库转入BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的LB平板上，挑选单克隆进行菌检，目标条带0.8kb，菌检体系如表2：
[0028]表2菌检体系
[0029][0030]随机挑选菌检结果阳性的单克隆接种到24孔板中，每孔中含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的4ml液体LB培养基，37℃，220rpm/min摇床培养16h，取培养液以3％体积比接种到含有50mg/ml的卡纳霉素的50ml液体TB培养基中，37℃，220rpm/min摇床培养至OD600＝0.4～0.6时，加入诱导剂：IPTG(终浓度为50umol/L)，25℃，220rpm/min摇床诱导培养16h，经过酶活、蛋白电泳检测，摇瓶小试验证，筛选出可溶性表达且酶活较高的菌种，将含有酶活较高的菌种的发酵液于高速冷冻离心机4℃条件下，6000rpm离心30min，收集湿菌体，保藏于
‑
20℃冰箱中。通过本实施例获得了4株高活力突变型菌株，分别进行烟酰胺核糖激酶的基因
的测序，4株突变株1～4中的突变的烟酰胺核糖激酶氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2～5所示。氨基酸残基的突变位点主要为突变体1的108D缺失，突变体2：S161T，突变体3：E123L D143E，突变体4：L65F N90I。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。2.编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。4.包含权利要求2或3所述的基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，是将质粒pET
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28a用BamHI和HindIII双酶酶切，与权利要求2或3所述基因连接获得。6.包含权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的重组载体的感受态细胞。7.根据权利要求6所述的感受态细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：周浩，胡昊，谷平，濮梦华，汪国平，夏伟，
申请(专利权)人：江西海文生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：