用于探针法qPCR的TaqDNA聚合酶突变体制造技术

本申请属于分子生物学技术领域，尤其涉及用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体。本申请中基于探针法qPCR对Taq DNA聚合酶突变体进行设计、表征和筛选，采用快速扩增时间(延伸期1秒)的循环过程，获得了部分Taq DNA聚合酶突变体。与野生型Taq DNA聚合酶相比，本申请提供的突变体具有快速检测扩增结果的特点，这显著降低了qPCR过程所需的总时间，提高了qPCR或实时qPCR的检测效率。因此，本申请提供的突变体具有较大的经济优势。本申请提供的Taq DNA聚合酶突变体可以用于常规的qPCR检测，包括基因表达分析和其他DNA定量检测。表达分析和其他DNA定量检测。表达分析和其他DNA定量检测。

【技术实现步骤摘要】
用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体


[0001]本申请属于分子生物学
，尤其涉及用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体。

技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶一般在聚合酶链式反应(PCR)中用于核酸扩增子的扩增。在PCR反应中，扩增子(目标核酸或目标DNA片段)一般通过三个步骤的循环进行扩增得到：变性、退火和延伸。实时荧光定量PCR(qPCR)是在PCR扩增的过程中，通过收集染料或探针产生的荧光信号数据，实现对扩增结果的检测和记录。基于探针的检测技术是指借助荧光标记的靶向探针进行检测的技术，当荧光探针与目标序列结合时释放荧光染料，可以通过实时检测荧光信号强度的改变推测扩增的进程。
[0003]Taq DNA聚合酶具有DNA聚合酶活性和5
′→3′
外切酶活性，这也是探针法qPCR得以实现的基础。由于探针法qPCR的扩增子通常较短，因此，即使是在较短的扩增时间间隔内(如1秒)，野生型Taq DNA聚合酶的聚合活性也足以满足扩增要求。但是，无论扩增期间是否发生聚合，野生型Taq DNA聚合酶都无法在1秒钟内将探针从其附着的荧光团中分离出来，这也就限制了检测速度。因此，Taq DNA聚合酶负责释放报告信号的5
′→3′
外切酶活性成为探针法qPCR的限速因子。基于此，本申请提供能够提高5
′→3′
外切酶活性的TaqDNA聚合酶突变体，以实现qPCR的快速检测。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本申请提供了用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0005]本申请提供了一种Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列相较于野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列发生A77F的突变；所述野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述A77F表示SEQ ID NO.2中的第77位氨基酸由A突变为F。
[0006]进一步地，Taq DNA聚合酶突变体能够延伸引物，延伸条件限制在1秒内。
[0007]本申请还提供了编码如上述的Taq DNA聚合酶突变体的DNA序列。所述野生型Taq DNA聚合酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，A77F的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于，第77位氨基酸的密码子由GCC替换为TTC。
[0008]本申请还提供了包含如上述的DNA序列的载体。
[0009]本申请还提供了包含如上述的DNA序列的细胞。
[0010]本申请还提供了如上述的Taq DNA聚合酶突变体在核酸扩增中的应用。
[0011]本申请还提供了如上述的Taq DNA聚合酶突变体在qPCR中的应用。
[0012]本申请还提供了一种qPCR检测试剂盒，包括：目标序列引物、插入染料或标记的目标探针、以及如上述的Taq DNA聚合酶突变体。
[0013]进一步地，插入染料是SYBR Green或EvaGreen。标记被核酸外切酶从探针上剥离时会发出荧光。
[0014]本申请还提供了一种qPCR检测方法，反应体系20μL，包含4μL 50ng/μL Taq DNA聚合酶突变体，1μL 10μM正向引物，1μL 10μM反向引物，1μL 5μM标签探针，1μL模板，2μL 10x buffer，余量为水；反应程序为：95℃变性30秒；95℃退火4秒，60℃延伸1秒，40个循环；所述Taq DNA聚合酶突变体如上述。
[0015]进一步地，所述buffer包含20mM Tris
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HCl，80mM Tris
‑
Acetate，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，3mM Mg
‑
Acetate，0.1％
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X
‑
100，pH 8.8。
[0016]综上所述，本申请的优点及积极效果为：
[0017]本申请提供的Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶相比，qPCR效率更高。本申请中基于探针法qPCR对Taq DNA聚合酶突变体进行设计、表征和筛选，采用快速扩增时间(延伸期1秒)的循环过程，获得了Taq DNA聚合酶突变体A77F。
[0018]与野生型Taq DNA聚合酶相比，本申请提供的突变体具有快速检测扩增结果的特点，这显著降低了qPCR过程所需的总时间，提高了qPCR或实时qPCR的检测效率。因此，本申请提供的突变体具有较大的经济优势。
[0019]本申请提供的Taq DNA聚合酶突变体可以用于常规的qPCR检测，包括基因表达分析和其他DNA定量检测。
附图说明
[0020]图1是野生型(左图)及突变体A77F(右图)的扩增信号图；图中，X轴为周期数，Y轴为荧光信号(DR)，表示扩增过程中的荧光变化，圆点表示每个周期具体检测到的信号值。所有检测阈值线固定在0.02；所有突变体的qPCR程序都是重复运行的，如图所示，可以看到两组不同的点和线。
具体实施方式
[0021]本申请中的“约”、“大概”等词语，与数字一起使用时，通常指在实验误差范围内的数值(如均值在95％的置信区间内)或在数值
±
10％内的变量值，以较大的数值为界限。
[0022]术语“标记探针”是指用于扩增反应的标记探针，包括定量或qPCR分析，以及端点分析。这种标记探针可用于监测目标多核苷酸的扩增，适用于监测扩增子数量随时间的变化。
[0023]寡核苷酸标记探针包括但不限于5'
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核酸外切酶TaqMan探针(见美国专利No.5,538,848)、各种茎环分子信标(见美国专利No.6,103,476和No.5,925,517，无茎分子信标或线性信标(WO 99/21881)，PNA分子信标(如，美国专利No.6,355,421和No.6,593,091)，线性PNA信标，non
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FRET标记探针(如，U.S.专利No.6,150,097)，Sunrise/amplfluor标记探针(美国专利No.6,548,250)、茎环和双蝎形标记探针(美国专利No.6,589,743)，凸环标记探针(美国专利No.6,59091)，伪结标记探针(美国专利No.6,589,250)；循环子(美国专利No.6,383,752)，发夹标记探针(美国专利No.6,596,490)、肽核酸(PNA)发光标记探针、自组装纳米粒子标记探针和二茂铁修饰标记探针等，如美国专利No.6485901。标记探针也可以包括黑洞猝灭剂(Biosearch)，爱荷华黑(IDT)猝灭剂，QSY猝灭剂(分子标记探针)，以及
Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(Epoch)。标记探针也可以由两个探针组成，如，荧光团位于其中一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列相较于野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列发生A77F的突变；所述野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述A77F表示SEQ ID NO.2中的第77位氨基酸由A突变为F。2.编码如权利要求1中所述的Taq DNA聚合酶突变体的DNA序列。3.根据权利要求2所述的Taq DNA聚合酶突变体的DNA序列，其特征在于，所述野生型Taq DNA聚合酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，A77F的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相比，区别仅在于，第77位氨基酸的密码子由GCC替换为TTC。4.包含如权利要求2中所述的DNA序列的载体。5.包含如权利要求2中所述的DNA序列的细胞。6.如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体在核酸扩增中的应用。7.如权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体在qPCR中的应用。8.一种qPCR检测试剂盒，其特征在于，包括：目标序列引物、插...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱振宇，孙大鹏，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：