一种烟酰胺核糖激酶的高密度发酵工艺及生产NMN的应用制造技术

本发明专利技术提供一种烟酰胺核糖激酶的高密度发酵工艺及生产NMN的应用，所述的烟酰胺核糖激酶具有更高的酶活，降低了NRK激酶的生产成本。提高了NMN的催化效率，解决了NMN生产过程中催化剂制备成本较高的问题，NMN的转化率高达98％，NMN的纯度最高达到99.9％。发酵阶段分为两个阶段，使得重组烟酰胺核糖激酶基因工程菌实现高密度发酵，不仅提高了产烟酰胺核糖激酶的工程菌的菌浓度(菌浓度OD600最高达到270，菌体湿重达到300g/L)，还提高了烟酰胺核糖激酶的酶活，获得了烟酰胺核糖激酶活最高超过105U/mL的发酵液。过105U/mL的发酵液。

【技术实现步骤摘要】
一种烟酰胺核糖激酶的高密度发酵工艺及生产NMN的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及的是一种烟酰胺核糖激酶的高密度发酵工艺及生产NMN的应用。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸(β
‑
NMN)是NAD
+
(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，NAD
+
是三羧酸循环的重要辅酶，促进糖、脂肪、氨基酸的代谢，参与能量的合成；NAD
+
参与人体的新陈代谢的方方面面，是关键性的辅酶，在人体抗衰老中起到重要作用。但是随着年龄的增长，人体内的NAD
+
水平是在逐渐下降的，导致线粒体活性降低，加速线粒体、细胞乃至整个机体的衰老，并且逐渐进入恶性循环，新陈代谢就会下降，进入衰老阶段。通过额外补充NAD
+
，理论上可以全面抗衰老。然而，现实情况是NAD
+
分子比较大，外部直接补充的NAD
+
很难透过细胞膜，进入细胞内部。于是，研究得重点转向补充合成NAD
+
的各类前体物质研究发现，前述大部分物质都存在副作用过大或转化效率过低的问题。而NMN的补充则未发现任何不良反应，并且NMN在体内能高效率地转化为NAD
+
。该结论也使得NMN成为全球各大医药和食品公司争相开发的对象。
[0003]传统的NMN的生产是采用化学合成，以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。然而化学合成磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分离纯化极其困难，总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，环境污染严重，因而，目前NMN主要采用生物酶法来制备。
[0004]NMN的生物酶法制备主要有两条途径：第一条是以D
‑
核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN；该条路线底物转化率不高(以烟酰胺计算，最高不超过50％)，且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。第二条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高，是NMN的主流生产方法，但是该方法还是存在转化率低等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种烟酰胺核糖激酶的高密度发酵工艺及生产NMN的应用。
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种烟酰胺核糖激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供编码所述烟酰胺核糖激酶的基因，所述基因可以按照本领域常规方法进行设计，在一种实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第二方面，提供本专利技术所述的烟酰胺核糖激酶在构建烟酰胺核糖激酶基因工程菌株中的应用。
[0009]本专利技术构建工程菌株可以按照本领域的常规方法和常用试剂、质粒、细胞等，例如通过重组质粒转入感受态细胞中形成工程菌株。在一种实施例，所用的质粒为pET
‑
28a(+)，
所用的感受态细胞为E.coli BL21(DE3)。
[0010]本专利技术的第三方面，提供一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1，所述菌株是感受态细胞E.coli BL21(DE3)通过转入烟酰胺核糖激酶基因后获得。
[0011]本专利技术的基因转入方法可以按照本领域的常规方法和常用试剂、质粒、细胞等，例如通过重组质粒转入感受态细胞中形成工程菌株。在一种具体的实例中，本专利技术还提供了具体的构建方法：采用核酸电泳初步确定两者的浓度，以基因/质粒pET
‑
28a(+)(mol/mol，2：1)进行混合，加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
NRk1。然后，将重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
NRk1转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
NRk1及重组菌株的正确性，最终获得烟酰胺核糖激酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1。
[0012]本专利技术所形成的菌株的培养方法可以按照本领域的常规方法。
[0013]本专利技术的第四方面，提供工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1在烟酰胺核糖激酶生产中的应用。
[0014]本专利技术的第五方面，提供一种烟酰胺核糖激酶的生产方法，采用工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1发酵产生，发酵过程采用分批补料方法：
[0015]A、细胞快速生长阶段：将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1的种子液按0.5～1.5％移种量接入发酵液，控制发酵温度30～38℃，通过通气与搅拌控制洛氧维持在35％
‑
40％；待基础发酵培养基营养物质耗尽，开始补料，补料速率按照如下公式计算：
[0016][0017]其中，X和S分别为细胞和底物浓度，g/L；μ为比生长速率，h
‑1；V为发酵液体积，L；S
F
为补加底物的浓度，g/L；Y
x/s
为甘油对细胞干重的得率系数，g/g；(VX)0为培养体系的初始细胞量，g；t为流加时间，h；
[0018]B、产酶阶段：当发酵液的OD
600
为50～70，将发酵液温度降至20～27℃，加入乳糖10～15g/L，期间采用DO
‑
Stat发酵方式，溶氧维持在35～40％，继续发酵70～75h，获得含有烟酰胺核糖激酶的发酵液。
[0019]在一些实施例中，为了简化操作，可以每一小时改变流加速率，改变后的流加速率根据公式计算得出。
[0020]在一些实施例中，本专利技术的基础发酵培养基为：19～21g/L甘油，31～33g/L酵母抽提物，17～18g/L Na2HPO4·
12H2O，2.5～3.5g/L KH2PO4，0.4～0.6g/L NaCl，0.9～1.1g/L NH4Cl和0.5～0.7g/L MgSO4，卡那霉素浓度为48～52ug/mL。
[0021]在一些实施例中，本专利技术的补料培养基为：200g/L～400g/L甘油，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟酰胺核糖激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述烟酰胺核糖激酶的基因；优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求2所述基因在构建烟酰胺核糖激酶基因工程菌株中的应用。4.一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1，其特征在于，所述菌株是感受态细胞E.coli BL21(DE3)通过转入权利要求2所述烟酰胺核糖激酶基因后获得。5.权利要求4所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1在烟酰胺核糖激酶生产中的应用。6.一种烟酰胺核糖激酶的生产方法，其特征在于，采用权利要求4所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1发酵产生，发酵过程采用分批补料方法：A、细胞快速生长阶段：将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET
‑
28a(+)
‑
NRK1的种子液按0.5～1.5％移种量接入发酵液，控制发酵温度30～38℃，通过通气与搅拌控制洛氧维持在35％
‑
40％；待基础发酵培养基营养物质耗尽，开始补料，补料速率按照如下公式计算：其中，X和S分别为细胞和底物浓度，g/L；μ为比生长速率，h
‑1；V为发酵液体积，L；S
F
为补加底物的浓度，g/L；Y
X/S
...

【专利技术属性】
技术研发人员：周浩，齐勇，王本超，谷平，钱前，
申请(专利权)人：江西海文生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：