早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法，属于鉴定植物性别的方法。本发明专利技术通过SNP标记的筛查，确定能稳定扩增且扩增产物在雌雄株之间存在差异的引物2‑1；用该引物在已知性别‘Hort 16A’猕猴桃自由授粉后代中进行PCR扩增，比对雌雄株之间的序列，确定能够鉴定性别的SNP标记；以雄性6号样本（X6）为对照，59bp处表现为t纯合的为雌性个体，表现为t/c杂合的为雄性个体；71bp处表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的为雄性个体。本发明专利技术简单、高效、快速，为‘Hort 16A’猕猴桃的生产实践提供了极大的便利。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物的遗传育种，涉及可早期鉴定植物后代性别的方法。
技术介绍
猕猴桃，藤本，多年生，大多为雌雄异株，为一类植物的总称。在猕猴桃属中，中华猕猴桃‘Hort 16A’果肉呈金黄色，富含不饱和脂肪酸和大量亚麻酸，果肉脆滑香甜，爽口多汁，单果的重量最高140g，每公斤果实中维生素C含量可达1200mg，是公认的优良品种，广泛栽培于亚热带地区，其性别表现有雌株、雄株、雌雄同株三种类型，有些雌株能产生有活力的花粉，有些雄株却不能正常传粉，甚至有能结果的雄株(McNeilage M A.Progress in breeding hermaphrodite kiwifruit cultivars and understanding the genetics of sex determination[J].Biologia Plantarum,1997,39(2):271-280)。对于种子和果实生产，‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代的雌株具有更重要的存在意义，其开放授粉后代遗传了母本的大部分的优良品质，同时后代出现了明显的性别分化，雌株和雄株的数量相当。但是，处于生长期的‘Hort 16A’猕猴桃植株从外部形态上不能区分出植株的性别，性别区分发生在花器官发育的后期差异上。雄花的花柱和柱头停止发育，雌蕊败育不形成胚珠，雄蕊饱满，充满有活力的花粉；雌花的雄蕊败育，几乎被发达似羽扇的花柱和柱头掩盖。然而，从种子播种到开花区分出雌雄，一般需要3～5年的时间。这期间内，没有多少生产意义的雄株不但增加了大量的培育成本，而且延长了杂交育种、改良品种、获得果实、选育雌性植株等的年限。早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株性别成为研究者们探索的重要问题。现有技术中，SCAR标记、AFLP标记等体系均可在核苷酸水平上比对筛查目标序列。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。以上术语的中英文含义是：SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions，特征序列扩增区域)标记。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)标记。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种可早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的方法，或者说，针对‘Hort 16A’猕猴桃的开放授粉后代，通过验证SCAR标记、筛选AFLP标记、筛查SNP标记，在DNA水平上发现该开放授粉后代植株的雌雄鉴别的早期鉴定方法。本专利技术所要解决的技术问题通过以下途径实现：可早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法，包括以下步骤：(1)取‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代植株，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA作为样本；(2)SNP标记的筛选，包括：针对性别相关基因片段，建立PCR反应体系，配置25μLPCR反应体系，其反应体系以下表的引物序列作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，扩增样本，筛选雌雄株之间的SNP差异：表1 SNP标记的引物序列(3)将步骤(2)扩增的核苷酸序列作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，筛选区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别 的SNP标记位点。进一步，所述的方法是：所述的步骤(2)是针对性别相关基因片段，以引物2-1R：5’ttagcacgctagggtcac3’和2-1F：5’aaggttagggtcgcaagt3’作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，使扩增出的序列具有雌雄之间的SNP差异。进一步，所述的方法是：所述的步骤(3)是将步骤(2)扩增的295bp核苷酸序列的雄性6号样本(X6)：作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，以59bp和71bp处作为区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记位点：其中，59bp处碱基表现为t纯合的为雌性个体，表现为t/c杂合的为雄性个体，71bp处碱基表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的雄性个体。本专利技术的有益效果是：以‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代为研究对象，通过验证SCAR标记、筛选AFLP标记以及筛查SNP标记之分子生物学方法，取得DNA水平的性别标记，提供了中华猕猴桃‘Hort 16A’开放授粉后代植株的雌雄鉴别的一种早期鉴定方法。具体是：(1)SCAR标记的验证：参考Gill的研究成果，验证SCAR标记引物在‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株之间的检测率。(2)基于AFLP标记的分析：建立AFLP遗传分析体系，比对条带，分析各项遗传参数，寻找与性别相关的AFLP标记。(3)基于SNP标记的筛查：通过SNP标记的筛查，找到一对可以在已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代雌雄株之间稳定扩增的引物；通过PCR扩增和测序比对，找到在雌雄株之间的SNP标记。即引物2-1F和引物2-1R扩增出来约295bp的核苷酸序列中，以雄 性6号样本(X6)为对照序列，59bp和71bp处可作为区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记。其中，59bp处碱基表现为t纯合的雌性个体，表现为t/c杂合的为雄性个体；71bp处碱基表现为g纯合的为雌性个体，表现为g/a杂合的雄性个体。本专利技术属于国家林业局948项目(2012-4-62)云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y332)和云南省高校林木遗传与繁育重点实验室研究生开放基金项目(YNGB201508)的资助项目。附图说明图1为已知性别‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代聚类图。图中，C10、CB1、C14、C16、C18、C21、C8、C21、C8、C11、C19、C20、C14、C12、C101、CB2均为雌性个体；X1、X9、X7、X2、X6、X13、X22、X15、X5、X24均为雄性个体。图2为雌雄株扩增序列比对结果。图3为通过步骤(2)引物扩增的295bp核苷酸序列的雄性6号样本(X6)。以下结合附图对本专利技术做进一步说明。具体实施方式1.以‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代已知性别植株为实验材料，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA。2.SCAR标记的验证(1)PCR反应体系根据Gill等(Gill G P,Harvey C F,Gardner R C,et al.Development of sex-linked PCR markers for gender identification in Actinidia[J].Theoretical&Applied Genetics,1998,97(97):439-445)的研究成果，分别验证3对SCAR标记引物：SMX、SMY、SMY1，具体序列见表1。配置25μLPCR反应体系，见表2。表1SCAR引物序列及Tm值Table 1The sequences and Tm value of SCAR primers表2PCR反应体系25μLTable 2The system of PCR re本文档来自技高网...
【技术保护点】
早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法，包括以下步骤：（1）取‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代植株，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA作为样本；（2）SNP标记的筛选，包括：针对性别相关基因片段，建立PCR反应体系，配置25μLPCR反应体系，其反应体系以下表的引物序列作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，扩增样本，筛选雌雄株之间的SNP差异；表 SNP标记的引物序列（3）将步骤（2）扩增的核苷酸序列作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，筛选区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记位点。
【技术特征摘要】
1.早期鉴定‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代性别的方法，包括以下步骤：（1）取‘Hort 16A’猕猴桃开放性授粉后代植株，利用Ezup柱式法提取植物基因组DNA作为样本；（2）SNP标记的筛选，包括：针对性别相关基因片段，建立PCR反应体系，配置25μLPCR反应体系，其反应体系以下表的引物序列作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，扩增样本，筛选雌雄株之间的SNP差异；表 SNP标记的引物序列（3）将步骤（2）扩增的核苷酸序列作为雌雄株之间的SNP标记的对照序列，比对雌雄株之间的SNP位点，筛选区分‘Hort 16A’猕猴桃开放授粉后代性别的SNP标记位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤（2）是针对性别相关基因片段，以引物2-1R：5’ttagcacgctagggtcac3’和2-1F：5’aaggttagggtcgcaagt3’ 作为PCR扩增SNP差异的上下游引物，使扩增出的序列具有雌雄之间的SNP差异。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述的步骤（3）是将步骤（2）扩增的295bp核苷酸序列的雄性6号样本（X6）：atgaattta...
【专利技术属性】
技术研发人员：张汉尧，贺笑，张先昂，刘小珍，刘艳艳，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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