一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，包括Nanog‑F ATGCCTGGTGAACCCGAC和Nanog‑R AGGACTGGATGTTCTGGGT，以及β‑actin‑F CACGAAACTACCTTCAACTCC和β‑actin‑R CATACTCCTGCTTGCTGATC。检测方法包括以下步骤：(1)提取间充质干细胞，并传代培养；(2)提取各代次间充质干细胞的总RNA，进行RT‑PCR扩增；(3)使用所述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增。该引物特异性好、准确性高、灵敏度高，检测方法简单，可检测出基因表达量的微小变化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法。
技术介绍
2003年，Chambers等和Mitsui等几乎同时报道了一种在囊胚内细胞群(inner cell mass，ICM)、原始生殖细胞以及胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)表达的新转录因子，命名为Nanog。Nanog基因属于ANTP类，NK家族基因，在人定位于12号染色体12p13～31，其cDNA由2184个核苷酸租成，包涵1个开放阅读框，编码305个氨基酸组成的多肽。Nanog基因的发现是在研究维持ESCs亚全能性和胚胎发育的相关基因方面取得的最大进展，除了有助于ESCs自我更新和维持其未分化状态，还能够促进细胞增殖。去除Nanog基因将会导致ESCs向原始内胚层样细胞的分化，说明Nanog是组织ESCs分化为原始内胚层的关键因子。有研究认为Nanog基因也是“逆转因”(reversine)物质，可以把普通细胞转变为胚胎细胞，再指导新细胞生长出人类需要的各种人体组织，来代替已失去功能的组织器官，这也是再生医学时代到来的原因之一。也有人应用Northern Blot和逆转录-聚合酶链反应检测小鼠肾脏中Nanog基因的曾龄变化，发现肾乳头区细胞表达较高，并且有年龄依赖性行为。Izadpanah等在研究成年恒河猴间充质干细胞是否具有多项分化潜能时，发现有Nanog的表达。同时，研究发现在睾丸原位癌和睾丸原位癌来源的睾丸肿瘤中有大量Nanog表达，并具有统计学意义，而在正常睾丸中没有检测到该基因蛋白质水平的表达。这说明Nanog可能是某些肿瘤标志之一，并在一定程度上解释了这些 肿瘤细胞可以无休止增殖的原因。因此，通过检测间充质干细胞中Nanog基因的表达变化对再生医学的应用、细胞治疗和基因治疗领域都具有重要意义。本领域迫切需要特异性好、灵敏都高的检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量变化的方法。而在很多基因表达量研究中，大多采用Northern印迹法或者RT-PCR后进行电泳的方法来检测基因的表达量，但是Northern印迹法检测效率不高，灵敏度也低，无法检出微小的基因表达量变化，RT-PCR电泳的方法由于产物量因为酶体系的影响而产生的波动在呈指数增长的PCR中会被转化成产物量间很大的差异，所以准确性不是很好。
技术实现思路
针对于现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法，可有效解决现有技术中的检测效率不高、灵敏度较低、准确性不好的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，包括Nanog基因的上游引物5'-ATGCCTGGTGAACCCGAC-3'和下游引物5'-AGGACTGGATGTTCTGGGT-3'，以及β-actin内参基因的上游引物5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'和下游引物5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。使用上述引物检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的方法，包括以下步骤：(1)提取间充质干细胞，进行传代培养；(2)提取各代次间充质干细胞的总RNA，然后进行RT-PCR扩增；(3)使用上述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增，确定Nanog 基因表达量。进一步地，RT-PCR反应体系为：Total RNA 0.1 ng-5μg、浓度为100μM的Oligo dT引物1μL，补充水至12μL，然后再添加5×Reaction Buffer 4μL、20U/μL的RiboLock RNase inhibitor 1μL、10mM dNTP MIX 2μL和200U/μL的RevertAid M-Mul V RT 1μL。进一步地，RT-PCR扩增条件为：42℃ 60min，然后70℃ 5min。进一步地，实时荧光定量PCR反应体系为：Fast SYBR Green Master mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA 2μL，然后添加水至20μL。进一步地，实时荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火60s，共39个循环，最后72℃延伸1min。进一步地，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胎盘间充质干细胞。本专利技术提供的一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法，具有以下有益效果：(1)本专利技术提供了用于检测Nanog基因表达量的引物以及管家基因β-actin的引物，引物特异性好，准确性好，实现了Nanog基因表达量的检测，提高了检测的准确性。(2)本专利技术还提供了一种间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，采用此方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为间充质干细胞的标志基因研究、肿瘤标志基因的研究及再生医学中间充质干细胞的应用提供帮助。附图说明图1为脂肪间充质干细胞P1、P3、P5、P7和P10代中Nanog基因的实时 荧光定量PCR扩增图；图2为胎盘间充质干细胞P7代中Nanog基因的溶解曲线；图3为胎盘间充质干细胞P1、P3、P5、P7和P10代中Nanog基因的溶解曲线；图4为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和胎盘间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的计算结果图。具体实施方式实施例1一种间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，包括以下步骤：(1)提取间充质干细胞UC-MSCs：在生物安全柜中将脐带用生理盐水冲洗干净后，剥离羊膜上皮，去除脐动脉和脐静脉，然后将脐带胶质剪碎后加入30mL Ⅱ型胶原酶，置于37℃，200r/min下持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞，然后于1200r/min离心10min，弃上清，用D-Hank’s液轻柔冲洗细胞3次，无血清培养基(hyclone公司)重悬细胞，在37℃、体积分数为5％的CO2恒温培养箱内培养6-7d后全量换液，弃掉未贴壁细胞，根据粘附性差异使UC-MSCs与其他组织细胞分离，分离后细胞经过表面标志物鉴定，从而确定为UC-MSCs，然后使用胰蛋白酶将其消化后，在细胞瓶内接种1×106个细胞，添加20mL无血清培养基进行培养，每隔3-4d换液1次进行传代培养；AD-MSCs：取成人吸脂术后的脂肪组织，磷酸盐缓冲液(PBS)反复浸泡冲洗3次去除血液，加入等体积0.1％I型胶原酶，于37℃水浴震荡消化1h，低糖DMEM(Gibco)终止消化，2000r/min离心5min，弃上清，再用低糖DMEM 重悬沉淀，200目滤网过滤，向沉淀中再加入3mL低糖DMEM，吹打均匀后移入培养瓶，于37℃、体积分数为5％的CO2恒温培养箱内培养24h后，首次换液，去除残余的红细胞及未贴壁细胞，根据黏附性差异使AD-MSCs与其他组织细胞分离，分离后细胞经过表面标志物鉴定，从而确定为AD-MSCs，然后使用胰蛋白酶将其消化后，在细胞瓶内接种1×106细胞，添加20mL无血清培养基培养,以后每隔3～4d换液1次进行传代培养；PMSCs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，其特征在于，包括Nanog基因的上游引物5'‑ATGCCTGGTGAACCCGAC‑3'和下游引物5'‑AGGACTGGATGTTCTGGGT‑3'，以及β‑actin内参基因的上游引物5'‑CACGAAACTACCTTCAACTCC‑3'和下游引物5'‑CATACTCCTGCTTGCTGATC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，其特征在于，包括Nanog基因的上游引物5'-ATGCCTGGTGAACCCGAC-3'和下游引物5'-AGGACTGGATGTTCTGGGT-3'，以及β-actin内参基因的上游引物5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'和下游引物5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。2.一种间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取间充质干细胞，进行传代培养；(2)提取各代次间充质干细胞的总RNA，然后进行RT-PCR扩增；(3)使用所述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增，确定Nanog基因表达量。3.根据权利要求2所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，其特征在于，RT-PCR反应体系为：Total RNA 0.1ng-5μg、浓度为100μM的Oligo dT引物1μL，补充水至12μL，然后再添加5×Reaction Buffer 4μL、20U/μL的RiboLock RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，张蓉，马明，李晓瑞，林秀芳，
申请(专利权)人：成都中创清科医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51