一种霍山石斛的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种霍山石斛的鉴定方法。具体操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物：5’‑TTCGTGGGATGGGGTTC‑3’，下游引物：5’‑TGCACATCCGAGCCTGA‑3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物，若PCR扩增产物中含有200‑300 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有200‑300 bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有霍山石斛。本发明专利技术方法的操作步骤简单，只需要PCR仪、电泳仪和核酸检测仪等设备，即可实现对霍山石斛的准确鉴别；本发明专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，携带方便，提高了检测操作的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用于鉴定霍山石斛的方法。
技术介绍
霍山石斛（Dendrobium huoshanense）是安徽省大别山区特有的、国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）。由于霍山石斛同属的近缘植物比较多，导致混淆品较多。目前市场上主要的混淆品为河南石斛、铁皮石斛和金钗石斛。霍山石斛与同属混淆品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。丁小余等建立了枫斗类石斛的rDNA ITS全序列数据库，其中包括霍山石斛一个单倍型的ITS序列，研究发现枫斗类石斛在ITS区的种间差异显著而稳定，并利用该数据库对部分石斛属植物进行了准确鉴别，但没有进行霍山石斛样品的鉴别（丁小余，王峥峥，徐红，徐珞珊，周开亚，枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别，药学学报，2002，37（7）：567）。栗丹等利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定（栗丹，李振坚，毛萍，严雪锋，淳泽，马欣荣，基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析，园艺学报，2012，39（8）：1539），但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。
技术实现思路
为了实现霍山石斛快速的现场检测，本专利技术提供一种霍山石斛的鉴定方法。一种霍山石斛的鉴定操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP2s：5’-TTCGTGGGATGGGGTTC-3’，下游引物CP2a：5’-TGCACATCCGAGCCTGA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有200-300 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有200-300 bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有霍山石斛。进一步限定的鉴定操作技术方案如下：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25 µL，其中0.5 µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10 pmol的上游引物CP2s，1.0 µL含量为10 pmol的下游引物CP2a，2.5 µL 10×buffer缓冲液，1.5 µL浓度为25 mM的氯化镁水溶液，0.5 µL浓度为10 mM的dNTPs ，0.5 µL浓度为5U/µL的Taq DNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25 µL；PCR扩增反应条件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环；72 ℃ 10 min。步骤（2）的具体操作如下：取5 µL PCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；若PCR扩增产物中含有262 bp的DNA片段，则所述待测样品为霍山石斛；若PCR扩增产物中未含有262 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。一种用于霍山石斛鉴定的试剂盒，将所述PCR反应体系中的上游引物CP2s和下游引物CP2a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP2s和下游引物外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成一个用于鉴定霍山石斛的检测试剂盒。进一步限定的试剂盒技术方案如下：根据进一步限定的鉴定操作技术方案所述的检测试剂盒，在每次检测时，需要从检测试剂盒中取用不同的物质，各种物质所取的量必须满足进一步限定的鉴定操作技术方案中PCR反应体系中各物质量的要求。本专利技术的有益技术效果体现在以下方面：1.本专利技术方法的操作步骤简单，只需要PCR仪、电泳仪和核酸检测仪等设备，即可实现对霍山石斛的准确鉴别。2.本专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的试剂盒，携带方便，提高了检测操作的效率。附图说明图1为霍山石斛及混淆品的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100 bp）；1：河南石斛；2：金钗石斛；3：铁皮石斛；4：霍山石斛；5：空白对照。图3为特异性PCR引物对CP2（上下游引物分别为CP2s和 CP2a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100 bp）；1：用特异性PCR引物对CP2扩增1个河南石斛样本的结果；2：用特异性PCR引物对CP2扩增1个金钗石斛的结果；3：用特异性PCR引物对CP2扩增1个铁皮石斛样本的结果；4：用特异性PCR引物对CP2扩增1个霍山石斛样本的结果；5：空白对照。图4为特异性PCR引物对CP2（上下游引物分别为CP2s和 CP2a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为600、500、400、300、200和100 bp）；1到4：霍山石斛DNA模板浓度依次为50 ng/μl、25 ng/μl、12.5 ng/μl和6.25 ng/μl；5到8：河南石斛DNA模板浓度依次为50 ng/μl、25 ng/μl、12.5 ng/μl和6.25 ng/μl；9到12：铁皮石斛DNA模板浓度依次为50 ng/μl、25 ng/μl、12.5 ng/μl和6.25 ng/μl；13到16：金钗石斛DNA模板浓度依次为50 ng/μl、25 ng/μl、12.5 ng/μl和6.25 ng/μl。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步地描述。实施例1一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及混淆品的ITS序列，详见下表1。其中，本研究所得单倍型序列详见序列表中序列4至序列11所示。表1 霍山石斛及混淆品的ITS序列编号样品名称样品数量单倍型GenBank登录号本研究所得序列编号1铁皮石斛Dendrobium catenatum1Hap1KP7435432铁皮石斛Dendrobium catenatum1Hap2KF1434393金钗石斛Dendrobium nobile1Hap3EF6187324金钗石斛Dendrobium nobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobium henanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobium henanense6Hap6IHN1C; IHN1E; IHN1F; IHN1G;HNITS01; IHN1D7霍山石斛Dendrobium huoshanense3Hap7KF143476IHS1A IHS2D8霍山石斛Dendrobium huoshanense1Hap8JN388567分别用贝叶斯法（Bayesian inference, BI）和简约法（maximum parsimony, MP）进行系统发育分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种霍山石斛的鉴定方法，其特征在于操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP2s：5’‑TTCGTGGGATGGGGTTC‑3’，下游引物CP2a：5’‑TGCACATCCGAGCCTGA‑3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有200‑300 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有200‑300 bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有霍山石斛。

【技术特征摘要】
1.一种霍山石斛的鉴定方法，其特征在于操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP2s：5’-TTCGTGGGATGGGGTTC-3’，下游引物CP2a：5’-TGCACATCCGAGCCTGA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有200-300 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有200-300 bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有或候选不含有霍山石斛。2.根据权利要求1所述一种霍山石斛的鉴定方法，其特征在于：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25 µL，其中0.5 µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10 pmol的上游引物CP2s，1.0 µL含量为10 pmol的下游引物CP2a，2.5 µL 10×buffer缓冲液，1.5 µL浓度为25 mM的氯化镁水溶液，0.5 µL浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵群，陈乃富，陈存武，韩邦兴，戴军，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34