使用编码双链启动子一条链的引物的方法技术

本发明专利技术提供了通过使用编码双链启动子一条链的启动子引物获得环形单链DNA转录底物而由RNA聚合酶来制备对应于靶序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。本发明专利技术对于研究、诊断和治疗应用例如制备对应于mRNA的cDNA、制备有义或反义探针、检测基因或生物体特异性序列或制备RNAi等具有广阔的适用性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体上涉及通过使用编码双链启动子一条链的启动子引物获得环形单链 DNA转录底物而由RNA聚合酶来制备对应于靶序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。本专利技术对于研究、诊断和治疗应用例如制备对应于mRNA的cDNA、制备有义或反义探针、检测基因或生物体特异性序列或制备RNAi具有广阔的适用性。
技术介绍
相关领域的说明本领域众所周知，若将靶序列插入到克隆载体中转录启动子如但不限于T7RNA聚合酶启动子或另外的T7型RNA聚合酶启动子的下游，并将所得的克隆在转录条件下与识别相应启动子的RNA聚合酶温育，或将所述克隆转化进能够表达此RNA聚合酶的宿主细胞中，则该靶序列可在体外或体内转录(例如参见Studier, Fff等，pp. 60-89 in Methods in Enzymology, Vol. 185，Goeddel，DV 编辑，Academic Press，1990，特此并入作为参考)。在合适的条件下，此系统也可用于在体外或在体内在适当的宿主细胞中表达由包含基因的靶序列编码的蛋白。转录一个或多个靶核酸序列有益的原因有多种。例如，体外转录被频繁地用在制备对应于样品中的mRNA序列的探针的方法中，以描述相对于另一类或相对于相似类型的特定类型细胞中基因响应不同的条件或刺激物的表达谱。当前基因表达谱分析典型地是通过同时将由一个或多个样品制备的标记探针与将多达数百种或数千种不同基因序列连接到表面上的阵列或微阵列进行杂交进行的。在有些情况下，特定基因的表达或表达的缺乏可能与病态如但不限于癌症的存在或状态有关，或可指示之。许多为此类目的制备对应于靶序列的探针的方法是本领域公知的。涉及体外转录以制备探针用于基因表达谱分析的方法的实例描述在=Murakawa等，DNA 7 =287-295, 1988 ；Phillips 禾口 Eberwine，Methods in Enzymo1. Supp1. 10:283-288,1996 ；Ginsberg 等，Ann. Neurol. 45 :174-181，1999 ；Ginsberg 等，Ann. Neurol. 48 :77-87,2000 ；VanGeIder 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1663-1667，1990 ；Eberwine 等，Proc. Natl. Acad. ScL USA 89 :3010-3014,1992 ；美国专利 No. 5，021，335 ；5，168，038 ；5，545，522 ；5，514，545 ； 5，716，785 ；5，891，636 ；5，958，688 ；6，291，170 以及 PCT 专利申请 WO 00/75356 和 WO 02/065093 中。又有其它方法使用体外转录作为用于扩增和检测一种或多种靶核酸序列的步骤的一部分，以便为医疗目的检测作为致病因子的病原体如病毒或微生物病原体的存在，或检测与疾病或疾病状态相关的基因序列。将体外转录用于此目的的方法的实例包括美国专利 No. 5，130，238 ；5，194，370 ；5，399，491 ；5，409，818 ；5，437，990 ；5，466，586 ；5，554，517 ； 5，665，545 ；6，063，603 ；6，090，591 ；6，100，024 ；6，410，276 ；Kwoh 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86 :1173,1989 ；Fahy 等，In :PCR Methods and Applications, pp.25-33, 1991 ；PCT专利申请号W089/06700和WO 91/18155以及欧洲专利申请No. 0427073A2和 0427074A2。单链DNA模板用于转录的用途并不常见。不过，Milligan等(Nucleic Acids Res.，15 :8783-8798,1987)证明双链DNA模板并非是利用T7RNA聚合酶合成RNA所必需的，条件是单链DNA模板含有双链-17至+1T7启动子区。并且，利用非共价地固定在固相支持物上的单链DNA模板通过与互补启动子序列退火合成RNA的方法描述在美国专利 No. 5,700,667中。另外，授予Aono Toshiya等的日本专利No. JP4304900公开了利用具有双链T7RNA聚合酶启动子的环形单链模板合成RNA。JP4304900中公开的用于转录的环形底物是通过连接线性探针获得的，该线性探针具有当其与样品中的靶序列退火时彼此邻近的靶互补性3'-和5'-端序列。然而，所有上文所引述的通过复制靶核酸序列获得探针和转录底物的方法涉及合成包含可操作地连接于双链模板的双链转录启动子的线性双链DNA。本领域通过靶序列复制获得探针或转录底物的方法使用双链DNA模板的原因是可以理解的，如果详细研究这些方法的过程的话。例如，Van Gelder等在美国专利 No. 5，545，522,5, 716，785和5，891，636中描述的方法利用启动子引物合成双链转录底物。 首先，利用这样的启动子引物反转录mRNA靶，该引物包含位于互补于一个或多个mRNA靶序列的3'-端部分5'端的启动子序列。然后，利用RNA或来自第一链cDNA的发夹作为引物合成第二链cDNA。由于RNA聚合酶以5'-至-3'的方向转录模板链，使用根据此法的启动子引物，启动子序列能够以正确的取向结合到靶序列上的唯一方法是在第二链cDNA 的3'-端复制启动子引物的启动子序列。也就是说，该启动子引物的启动子序列利用第二链cDNA作为模板指导RNA转录。用于转录的模板链因此具有与样品中的mRNA靶序列完全相同的Watson-Crick碱基配对序列，且转录产物包含反义RNA。Van Gelder等的启动子引物中所用的单链启动子序列为有功能双链启动子的一条链，在文中称之为“反义启动子”， 而相应的启动子引物在文中称之为“反义启动子引物”。类似地，双链启动子中可操作地连接于模板链的启动子序列在文中称之为“有义启动子序列”，而包含此序列的启动子引物称之为“有义启动子引物”。本专利技术部分地提供了利用有义启动子引物以获得对应于靶序列的转录产物的新方法。该法制备包含编码靶序列的单链DNA模板的转录底物，该ssDNA模板可操作地连接于有功能的双链启动子。本专利技术的另外方面将会因下文的说明书而被理解。专利技术简述本领域的方法使用反义启动子引物，而本专利技术的有些实施方案提供了使用有义启动子引物的方法。从而，作为实例，但并非就用于转录的启动子序列或相应的RNA聚合酶而言限制本专利技术，尽管美国专利No. 5，545，522,5, 716，785和5，891，636的启动子引物中所用的反义T7启动子序列和+1碱基为(5' TAATACGACTCACTATAG 3')；能够用于本专利技术有些实施方案的启动子引物中的对应有义T7启动子序列和+1碱基为(5‘ CTATAGTGAGTCGTATTA 3')。本专利技术提供了通过转录环形转录底物用于产生对应于样品中的靶核酸序列的转录产物的方法、组合物和试剂盒。如附图说明图1所示，获得环形转录底物的方法的第一步是有义启动子引物通过利用靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于制备对应于靶核酸中的靶序列的转录产物的方法，该方法包括：（ａ）获得靶核酸；（ｂ）获得有义启动子引物，该有义启动子引物包括含有有义转录启动子的５′－端部分以及互补于靶的３′－端部分；（ｃ）使有义启动子引物与靶核酸退火，以形成靶核酸－有义启动子引物复合体；（ｄ）使靶核酸－有义启动子引物复合体与ＤＮＡ聚合酶在聚合反应条件下接触，以获得互补于靶序列的第一链ｃＤＮＡ；（ｅ）获得第一链ｃＤＮＡ；（ｆ）在连接条件下连接第一链ｃＤＮＡ，以获得含有义启动子的环形第一链ｃＤＮＡ；（ｇ）获得反义启动子寡核苷酸；（ｈ）使反义启动子寡核苷酸与含有义启动子的环形第一链ｃＤＮＡ退火，以获得环形转录底物；（ｉ）获得环形转录底物；和（ｊ）使环形转录底物与ＲＮＡ聚合酶在转录条件下接触，其中获得转录产物。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·A·达尔，J·J·詹得里萨克，
申请(专利权)人：震源技术公司，
类型：发明
国别省市：US