一种高效提取热带植物DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效提取热带植物DNA的方法，取热带植物的叶片、根、茎或果实，粉碎，置于无菌容器中，加入本发明专利技术的裂解缓冲液，混匀；调节温度为60-70℃进行水浴反应20-40min，取反应后混合溶液离心，取上清液，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃去上清液，取沉淀物，采用有机溶剂洗涤2-5次，每次洗涤后，离心，弃去上清液，将离心后的沉淀干燥即获得提取的热带植物的总DNA。该提取方法不需要使用诸如β-巯基乙醇、氯仿和酚一类的有毒有害成分，从而使得本方法具有安全性和友好性的特点；并且该提取方法还具有通用、高效、安全和简便的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA的提取方法，具体涉及一种高效提取热带植物DNA的方法。
技术介绍
高质量DNA是进行分子生物学研究的重要保证。迄今为止，人们提出了诸多提取DNA的方法，譬如基于化学溶液提取的方法和运用过柱吸附提取的方法(安泽伟等， 2009)。然而，不同的材料会对提取DNA的方法有特异性的要求，特别是对于某些顽拗性和稀有的材料更是如此(Hasan, et al, 2008; Rogers and Bendich, 1985; Tang, et al, 2009)。热带植物富含的纤维素、多糖、多酚、蛋白、脂肪等物质使得细胞难以裂解，核酸难以分离和纯化，因此增加了 DNA提取的难度(Wang，et al, 2008)。目前，虽然研究者报道了一些从热带植物组织中提取DNA的方法，比如从热带植物块根中提取DNA的方法(Siarma， et al, 2008)，以及提取香蕉树(Shankar, et al, 2011)、橡胶树(An and Huang, 2005)、 椰树(Angeles，et al. , 200 等热带植物DNA的特异性方法，但是此类方法具有明显的局限性。因此，亟待开发一种能够适用于热带植物DNA提取的通用型方法以适应诸如大规模研究的需求。申请号为200910095919. 2的专利，提出了一种采用CTAB的方法同时提取山药等植物中DNA和RNA的方法，该方法的试剂中含有β -巯基乙醇等有害物质，同时还采用了氯仿和酚等有毒有害物质进行了除杂，其对环境危害大，提取过程安全性较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效提取热带植物DNA的方法，该方法通用、高效、安全和简便。本专利技术的上述目的是通过如下步骤来实现的一种高效提取热带植物DNA的方法，取热带植物的叶片、根、茎或果实，粉碎，置于无菌容器中，加入裂解缓冲液，混勻；调节温度为60-70°C进行水浴反应20-40 min，取反应后混合溶液离心，取上清液，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃去上清液，取沉淀物，采用有机溶剂洗涤2-5次，每次洗涤后，离心，弃去上清液，将离心后的沉淀干燥即获得提取的热带植物的DNA。本专利技术所述的裂解缓冲液含以下组分质量百分含量为m的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、200mM Tris、2M NaCl、质量百分含量为21的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、25mM 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、质量百分含量为1%的十二烷基肌氨酸钠(LSS)、20mM硼砂， 该裂解缓冲液的PH值为8. 0 ；所述的裂解缓冲液使用前先预热至60-70°C。与传统CTAB方法所使用的裂解缓冲液相比，本专利技术裂解缓冲液含有更多的NaCl、 EDTA和Tris成分。这些成分使得裂解缓冲液中具有丰富的Na+和Cl_，从而为组织裂解提供了高盐条件，同时使反应体系保持稳定的酸碱度。本专利技术裂解缓冲液不含巯基乙醇， 而代以PVPP这种安全和易用的成分以维持反应体系的还原环境，防止多酚氧化成难以去除的多醌类物质。此外，本专利技术裂解缓冲液中加入了 1%的LSS。LSS是一种阴性去污剂，具有促进细胞裂解的作用。不仅如此，还在本专利技术裂解缓冲液中加入了 20 mM的硼砂以结合多糖和多酚类物质，促进非核酸类组分的沉淀。本专利技术所述的热带植物叶片、根、茎或果实和裂解缓冲液的质量体积比为 lg:5-20mL。本专利技术在水浴反应的过程中每隔3-5 min将反应液混勻一次。本专利技术在采用异丙醇沉淀DNA时，异丙醇的用量为混合溶液离心后上清液总体积的 0. 6-0. 8 倍。本专利技术洗涤时的有机溶剂为乙醇，乙醇的体积百分含量为70-99. 5%，乙醇洗涤前先预冷至3-5 °C。本专利技术提取的热带植物的DNA保存于含有RNase A的TE缓冲液中在_20°C保存备用。本专利技术含有RNase A的TE缓冲液中TE缓冲液的组成为pH值为8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值为8. 0的1 mM EDTA，含有RNase A的TE缓冲液中RNase A的质量浓度为 10 Pg/mL。本专利技术离心时离心机的转速为10000-15000 rpm，温度为3_5°C，离心时间为1-10 min。本专利技术所述的热带植物优选为金钱菊、大王椰子树、番木瓜树、无花果树、海马齿、 木薯、橡胶树、烟草、假槟榔树或香蕉树。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点(1)不需要使用诸如β-巯基乙醇、氯仿和酚一类的有毒有害成分，从而使得本方法具有安全性和友好性的特点；(2)利用本方法从热带植物组织提取获得的DNA量显著高于普通提取方法提取获得的 DNA量，且DNA纯度符合下游应用的要求；(3)经PCR和酶切实验证明最终获得的DNA能够达到一般分子生物学研究的要求；(4)本专利技术提取方法具有通用、高效、安全和简便的特点。附图说明图1是本专利技术实施例中提取的10种热带植物叶片总DNA的电泳结果，其中为比较产率，在用50 PL含有RNase A的TE缓冲液溶解DNA以后，各样品点样孔都只加入10 μ 的DNA溶液，Μ, DNA marker (Trans 15k, Trans) ； 1，金钱菊；2，大王椰子树；3，番木瓜树； 4，无花果树；5，海马齿；6，木薯；7，橡胶树；8，烟草；9，假槟榔树；10，香蕉树；图2是本专利技术实施例中提取的10种热带植物RBCL基因PCR电泳结果，其中各样品点样孔分别加入IOPL的PCR溶液，M，DNA marker (DL2000, Takara) ；1，金钱菊；2，大王椰子树；3，番木瓜树；4，无花果树；5，海马齿；6，木薯；7，橡胶树；8，烟草；9，假槟榔树；10，香蕉树；图3是本专利技术实施例中提取方法提取的6种热带植物EcoR I限制性酶切电泳结果，M， DNA marker (Trans 15k, Trans)，1，香蕉树；2，木薯；3，橡胶树；4，番木瓜；5，大王椰子树； 6，假槟榔树；图4是本专利技术提取方法与CTAB提取方法获得的木薯和橡胶总DNA的电泳图，其中为比较产率，在用50 μ 含有RNase A的TE缓冲液溶解DNA以后，各样品点样孔都只加入10 PL的DNA溶液。M，DNA marker (Trans 15k, Trans) ；Dd,本专利技术方法；Dc，本专利技术方法加入氯仿异戊醇(24:1)沉淀步骤；Dp，本专利技术方法加入酚氯仿异戊醇(2524:1)沉淀步骤；CTAB, CTAB提取DNA方法(Sambrook and Russell, 2001)。Μ. esculenta,ifM ； H. brasiliensis，檢胶树。具体实施例方式本专利技术裂解缓冲液成分 溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)(优选自Amresco，美国)；200 mM Tris (优选自北京索莱宝科技有限公司，中国)；2 M NaCl (优选自广州光华化工有限公司，中国)；洲聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)(优选自北京索莱宝科技有限公司， 中国)；25 mM乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)(优选自北京索莱宝科技有限公司，中国)；1% 十二烷基肌氨酸钠(LSS)(优选自北京索莱宝科技有限公司，中国)；20mM硼砂(优选自广州化学试剂厂，中国)，该缓冲液的酸碱度(PH)= 8.0。本专利技术采用的氯仿和异戊醇优本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高效提取热带植物ＤＮＡ的方法，其特征是：取热带植物的叶片、根、茎或果实，粉碎，置于无菌容器中，加入裂解缓冲液，混匀；调节温度为６０－７０℃进行水浴反应２０－４０　ｍｉｎ，取反应后混合溶液离心，取上清液，加入异丙醇沉淀ＤＮＡ，离心，弃去上清液，取沉淀物，采用有机溶剂洗涤２－５次，每次洗涤后，离心，弃去上清液，将离心后的沉淀干燥即获得提取的热带植物的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
1.一种高效提取热带植物DNA的方法，其特征是取热带植物的叶片、根、茎或果实， 粉碎，置于无菌容器中，加入裂解缓冲液，混勻；调节温度为60-70°C进行水浴反应20-40 min,取反应后混合溶液离心，取上清液，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃去上清液，取沉淀物， 采用有机溶剂洗涤2-5次，每次洗涤后，离心，弃去上清液，将离心后的沉淀干燥即获得提取的热带植物的DNA。2.根据权利要求1所述的高效提取热带植物DNA的方法，其特征是所述的裂解缓冲液的组成含有质量百分含量为洲的溴化十六烷基三甲基铵、200mM Tris、2M NaCl、质量百分含量为21的聚乙烯聚吡咯烷酮、25mM乙二胺四乙酸二钠、质量百分含量为1%的十二烷基肌氨酸钠、20mM硼砂，该裂解缓冲液的pH值为8. 0，所述的裂解缓冲液使用前先预热至 60-70 O。3.根据权利要求1或2所述的高效提取热带植物DNA的方法，其特征是所述的热带植物叶片、根、茎或果实和裂解缓冲液的质量体积比为lg:5-20mL。4.根据权利要求1所述的高效提取热带植物DNA的方法，其特征是在水浴反应的过程中每隔3-5 min将反应液混勻一次。5.根据权利要求1所述的高效提...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启星，王旭初，孔华，郭运玲，郭安平，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66