本发明专利技术“制备两个基因随机重组库的方法”，属于生物工程技术。以双脱氧末端终止法为基础，应用KOD?DNA聚合酶和Taq?DNA聚合酶不同的3′→5′外切能力，创建的一种新的产生单交换重组体的体外随机基因重组方法，应用这种方法将两种不同的基因进行正向重组和反向重组，得到一系列重组基因；利用高分辨溶解曲线(HRM)系统筛选出杂合基因；进一步表达蛋白，测定活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，特别是一种。
技术介绍
基因的连锁和交换定律的实质是在进行减数分裂形成配子时，位于同一条染色体上的不同基因，常常连在一起进入配子；在减数分裂形成四分体时，位于同源染色体上的等位基因有时会随着非姐妹染色单体的交换而发生交换，因而产生了基因的重组。但自然重组多发生在配对的同源染色体上，且交换重组的频率非常低，且由于存在连锁遗传现象， 自然条件下获得重组基因的种类非常有限。DNA聚合酶最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的共同性质是以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中的DNA链的3 ‘ -OH末端；催化DNA 合成的方向是5' -3'。一些DNA聚合酶具有3’ -5’或5’ -3’外切活性，不同聚合酶之间的外切活性不同，利用这种区别进行两个基因的重组，暂未见到文献报道。
技术实现思路
本专利技术根据上述领域的空白，提供一种制备随机重组基因和蛋白的方法。，所述两个基因命名为A基因和B基因，制备A、B 基因正向随机重组库的步骤如下(1)设计并合成以下引物A基因和B基因的正、反向引物；接头引物LApF :5’ -人工接头序列1+A的正向引物序列_3’，LBpR :5，-人工接头序列2+B的反向引物序列_3，；(2)不对称PCR制备A的反向单链模板以A基因的双链DNA为模板，PCR体系中的A基因的正向引物浓度高于A基因的反向引物，使不对称PCR主要产生A基因的反向单链；(3)不对称PCR获得B的反向单链模板以B基因的双链DNA为模板，引物为B基因的正向引物和B基因的反向接头引物 LBpR, PCR体系中反向接头引物LBpR浓度高于B基因的正向引物，使不对称PCR主要产生B 基因的反向单链；(4)单引物PCR获得A基因的正向随机长度片段以A基因的反向单链为模板，以LApF为引物，PCR体系中采用的dNIPs中还混有双脱氧三磷酸碱基核糖核苷酸中的一种，采用Taq聚合酶；⑶模板重组PCR:步骤(4)获得A基因的正向随机长度片段与步骤(3)获得的带接头序列的B基因反向单链混合，退火，延伸为完整重组双链，延伸聚合酶采用KOD聚合酶；(6)重组选扩PCR 以完整重组双链为模板，选扩引物为人工接头序列1和人工接头序列2，采用KOD聚合酶进行PCR扩增获得A、B基因正向随机重组库。所述人工接头序列内设计有用于克隆的酶切位点。步骤(6)的PCR产物经分离纯化回收得到的DNA片段克隆到载体质粒中，并转化感受态大肠杆菌。所述A基因为cry2Aa，B基因为cry2Ad，所述cry2Aa的正反向引物如下正向引物F :ATGAATAATGTATTGAATAGTGGA,反向引物R ATAAAGTGGTGGAAGATTAGTT，正向接头引物为LF :AACCTTGTAGCGCGGATCCGATGAATAATGTATTGAAT ；cry2Ad 的正向引物 F，为 ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGA，反向接头引物LR TTAGCTGGAAACGCGTCGACATAAAGTGGTGAAGATT ；重组基因选扩引物为SF :AACCTTGTAGCGCGGATCCG/SR TTAGCTGGAAACGCGTCGAC.所述不对称PCR制备cry2Aa的反向单链模板中，F与R的浓度比例为1 50 100 ；所述不对称PCR制备cry2Ad的反向单链模板中，F’与LR的浓度比例为1 50 100。步骤(4)中，退火，延伸程序如下94°C3min，60°C 3min，65°C 3min，68°C IOmin, 10°c保温。所述载体质粒指pEB，所述大肠杆菌感受态细胞指JMllO感受态细胞。上述方法制备得到的重组基因库中筛选得到的重组基因。所述筛选采用高分辨溶解曲线系统。获得重组蛋白的方法，指对上述重组基因表达的重组蛋白进行活性测定及功能筛选，获得具有功能的重组蛋白。本专利技术以双脱氧末端终止法为基础，应用KOD DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶不同的3' -5'外切能力，创建了一种新的产生单交换重组体的体外随机基因重组方法，应用这种方法将两种不同的基因(cry2Aa和cry2Ad基因)进行正向重组和反向重组，得到一系列重组基因。本专利技术提供了两个基因(cry2Aa和cry2Ad基因)正向重组的示例，本领域技术人员依照本专利技术给出的技术方案，可以得出反向重组方案。并且能够举一反三得出在选用不同双脱氧核糖核酸从而得出不同的基因重组库的方法。附图说明图1.本专利技术基因重组策略2.正向重组单引物PCRM :DM2000 Marker Lane 1 :cry2Aa 阳性对照 Lane 2 :cry2Aa单弓丨物PCR Lane 3 cry2Aa阴性对照5图3.反向重组单引物PCRM :DM2000Marker Lane 1 :cry2Ad 阳性对照 Lane 2 :cry2Ad 单引物 PCR, Lane 3 cry2Ad阴性对照图4.正向重组以及重组基因选扩PCRM :DM2000 Lanel :cry2Aa正向随机单链与cry2Ad反向单链重组，Lane2 正向重组基因选扩PCR，Lane3 :cry2Aa 阴性对照图5.测序重组位点及重组次数.重组体用R1-R37表示，括号中的数字表示各个类型重组体的个数图6. HRM筛选重组体红色重组体；黑色cry2Ad (正向重组)或cry2Aa (反向重组)；白色无信号图7. cry2Aa和cry2Ad在区域l_157bp的序列比对图 8. cry2Aa 和 cry2Ad 在区域 1743_1899bp 的序列比对图9.重组类型的数目与有效碱基A或T的数目的关系图10. KOD聚合酶3' - 5'外切能力对延伸能力的影响M :DM2000 Marker ；Lane 1 :cry2Ad 阳性对照；Lane 2:引物 3'末端有一个碱基不配对；Lane 3:引物3'末端有两个碱基不配对；Lane 4:引物3'末端有三个碱基不配对图11. cry2Aa、cry2Ad以及各种重组体在大肠杆菌Rosetta中的表达图12. R23和R24三级结构对比13.重组体R25和似6的氨基酸比对图14. R25和似6三级结构对比15. R26和R27三级结构对比16. cry2Aa基因以及定点突变基因在大肠杆菌Rosetta中的表达具体实施例方式以下通过具体实验说明本专利技术的技术方案。材料与试剂大肠杆菌JMllO质粒pEB，pEB2Ad(载有 Cry2Ad 基因的 pEB)，pEB2Aa (载有 Cry2Aa 基因的 pEB) 以及载有本专利技术获得的重组体基因的PEB质粒(其中包括载有8个定点突变体基因的pEB 质粒)，本实验室均有保存，可向公众发放用于验证试验。液体 LB :Tryptone 1%, Yeast extract 0. 5%, NaCl 1%, pH 7· 0，15 磅 20min ； 固体LB 在液体培养基中加1. 4%琼脂。氨苄青霉素，水溶液50mg/mL ；氯霉素，无水乙醇溶解，3%ig/mL。-20°C保存。酶及化学试剂KOD高保真DNA聚合酶购自博迈德，Ta本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．制备两个基因的随机重组库的方法，所述两个基因命名为Ａ基因和Ｂ基因，制备Ａ、Ｂ基因正向随机重组库的步骤如下：（１）设计并合成以下引物：Ａ基因和Ｂ基因的正、反向引物；接头引物：ＬＡｐＦ：５’－人工接头序列１＋Ａ的正向引物序列－３’，ＬＢｐＲ：５’－人工接头序列２＋Ｂ的反向引物序列－３’；（２）不对称ＰＣＲ制备Ａ的反向单链模板：以Ａ基因的双链ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ体系中的Ａ基因的正向引物浓度高于Ａ基因的反向引物，使不对称ＰＣＲ主要产生Ａ基因的反向单链；（３）不对称ＰＣＲ获得Ｂ的反向单链模板：以Ｂ基因的双链ＤＮＡ为模板，引物为Ｂ基因的正向引物和Ｂ基因的反向接头引物ＬＢｐＲ，ＰＣＲ体系中反向接头引物ＬＢｐＲ浓度高于Ｂ基因的正向引物，使不对称ＰＣＲ主要产生Ｂ基因的反向单链；（４）单引物ＰＣＲ获得Ａ基因的正向随机长度片段：以Ａ基因的反向单链为模板，以ＬＡｐＦ为引物，ＰＣＲ体系中采用的ｄＮＴＰｓ中还混有双脱氧三磷酸碱基核糖核苷酸中的一种，采用Ｔａｑ聚合酶；（５）模板重组ＰＣＲ：步骤（４）获得Ａ基因的正向随机长度片段与步骤（３）获得的带接头序列的Ｂ基因反向单链混合，退火，延伸为完整重组双链，延伸聚合酶采用ＫＯＤ聚合酶；（６）重组选扩ＰＣＲ：以完整重组双链为模板，选扩引物为人工接头序列１和人工接头序列２，采用ＫＯＤ聚合酶进行ＰＣＲ扩增获得Ａ、Ｂ基因正向随机重组库。...
【技术特征摘要】
2010.06.29 CN 201010212298.41.制备两个基因的随机重组库的方法，所述两个基因命名为A基因和B基因，制备A、 B基因正向随机重组库的步骤如下(1)设计并合成以下引物A基因和B基因的正、反向引物； 接头引物LApF :5’ -人工接头序列1+A的正向引物序列-3’， LBpR :5’ -人工接头序列2+B的反向引物序列_3’ ；(2)不对称PCR制备A的反向单链模板以A基因的双链DNA为模板，PCR体系中的A基因的正向引物浓度高于A基因的反向引物，使不对称PCR主要产生A基因的反向单链；(3)不对称PCR获得B的反向单链模板以B基因的双链DNA为模板，引物为B基因的正向引物和B基因的反向接头引物LBpR， PCR体系中反向接头引物LBpR浓度高于B基因的正向引物，使不对称PCR主要产生B基因的反向单链；(4)单引物PCR获得A基因的正向随机长度片段以A基因的反向单链为模板，以LApF为引物，PCR体系中采用的dNIPs中还混有双脱氧三磷酸碱基核糖核苷酸中的一种，采用Taq聚合酶；(5)模板重组PCR步骤(4)获得A基因的正向随机长度片段与步骤(3)获得的带接头序列的B基因反向单链混合，退火，延伸为完整重组双链，延伸聚合酶采用KOD聚合酶；(6)重组选扩PCR:以完整重组双链为模板，选扩引物为人工接头序列1和人工接头序列2，采用KOD聚合酶进行PCR扩增获得A、B基因正向随机重组库。2.根据权利要求1所述的方法，所述人工接头序列内设计有用于克隆的酶切位点。3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(6)的PCR产物经分离纯化回收得到的...
【专利技术属性】
技术研发人员：束长龙，耿丽丽，张杰，宋福平，黄大昉，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11
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