水稻MIR528基因启动子及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种水稻MIR528基因启动子及其应用，该启动子分离自粳稻日本晴，其序列含有多个逆境胁迫应答及植物生长发育相关调控元件。转基因证明，其为广谱性表达启动子；正常条件下其在水稻茎干中的表达活性优于35S启动子；而且其在水稻根系和叶片中可被亚砷酸盐显著诱导表达。本发明专利技术利用转基因技术验证了水稻MIR528基因启动子参与应答逆境胁迫的生物学功能，为植物抗逆基因工程研究提供了新的高效、广谱且环境诱导型启动子元件，为进一步解析植物响应逆境胁迫分子机制及抗逆育种应用了奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、基因工程
，尤其是一种水稻MIR528基因启动子及其应用。
技术介绍
在自然界，由于植物的不动性，其比动物更易遭受外界逆境因子胁迫。但是，植物可通过调节其基因组中不同类型基因的有序时空表达进而触发或启动其自身防御反应机制以应对各种胁迫。大量研究已证明，植物基因表达调控中，启动子具有中心地位，它决定着基因转录的方向和效率。miRNA是生物体内源产生的一类长度约20-24bp的非编码小RNA，其通过序列互补配对方式在转录后水平上调控靶基因的表达。研究发现，一种miRNA往往可调控多个靶基因表达，因而在植物生长发育以及应答外界逆境胁迫等过程中发挥着重要作用。目前，通过转基因等手段揭示miRNA生物学功能的研究取得一定进展，然而有关植物miRNA上游表达调控机制方面的报道鲜见。我们知道，miRNA尽管不编码蛋白质，但它与蛋白编码基因一样具有自身的启动子；其启动子上顺式作用元件的类型和数量决定着它的时空表达模式。因此，miRNA基因启动子的克隆和功能解析，对于深入探究植物生长发育过程、植物与环境互作机制以及转基因利用等具有重要理论和实践指导意义。砷是重要的环境污染物及人类I级致癌物。水稻是重要的粮食作物。但与小麦和玉米等旱粮作物相比，水稻可高效从土壤中吸收、转移与积累砷。因此，提高水稻对砷的耐受性、减少对砷的吸收是解决水稻砷污染的有效途径。我们发现，在耐砷水稻日本晴中过量表达miR528后可导致其对亚砷酸盐的耐性极显著下降，而将其抑制表达后转基因植株对砷的耐性得到明显恢复。另外我们发现，miR528过表达转基因水稻对高盐及干旱的耐受性亦显著降低。这表明，miR528与其靶基因互作在水稻应答亚砷酸盐、高盐及干旱等胁迫中起着重要调控作用。因此，利用基因工程手段解决水稻砷污染等逆境胁迫问题具有重要现实意义。然而，目前对MIR528基因自身转录调控的分子机制尚不清楚。本专利技术从粳稻品种日本晴基因组中克隆得到MIR528基因启动子，通过构建全长、分段缺失启动子融合GUS表达载体并转基因证实，该启动子有活性且可受到亚砷酸盐诱导表达；其为广谱性表达，它在茎秆中的表达活性甚至优于目前流行的35S启动子。这为进一步研究植物应答逆境胁迫的分子机制及该启动子的转基因利用奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术要解决上述现有技术的缺点，提供一种水稻MIR528基因启动子及其应用。该启动子具有典型的启动子序列特征，含有与胁迫相关的转录因子的结合位点。在水稻中，MIR528基因受到该启动子的调控，参与亚砷酸盐、盐害及干旱胁迫等逆境转导途径。本专利技术的水稻MIR528基因启动子，其具有：(a)序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(b)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由(a)衍生的核苷酸序列；或(c)与SEQIDNo.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA序列；或(d)在高严谨条件下可以与SEQIDNo.1所示核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是水稻特有的，它具有明显启动子序列特征，其具有多个TATA-box和CAAT-box等。通过转基因证明其能够驱动GUS基因表达，为有活性的广谱性表达启动子。本专利技术还提供含有所述启动子的表达载体、宿主菌以及含有所述启动子的转化水稻的种子。本专利技术还提供水稻MIR528基因启动子在植物中调控下游基因表达中的应用，其研究步骤为：启动子片段的克隆、植物表达载体的构建、转化植物、阳性转基因植株鉴定、GUS染色观察、GUS活性检测、GUS基因定量表达分析，所述的转化植物的方法是农杆菌介导法，优选下游基因为GUS基因。本专利技术还提供水稻MIR528基因启动子在调控植物耐逆性中的应用。其中，所述的植物耐逆性是指植物耐砷、耐盐和耐干旱等耐受逆境胁迫的能力，优选为启动子在应答亚砷酸盐胁迫中的应用。专利技术有益的效果是：本专利技术中克隆的水稻MIR528基因启动子是水稻特有的、全新的、可被亚砷酸盐诱导表达的启动子；上述启动子是一个高效、广谱表达启动子，其在水稻茎秆中的调控活性优于时下流行的35S启动子。克隆并利用转基因解析上述启动子的功能，有助于深入探析其转录调控机制以及在水稻响应逆境胁迫中的作用。另外，该启动子广谱、高效表达特性亦有望将其开发为高效驱动基因表达的新表达元件，为其在植物基因工程研究中的利用奠定基础。附图说明图1MIR528基因启动子的PCR克隆结果；图2MIR528全长和分段缺失启动子分布；图3MIR528基因分段缺失启动子的PCR克隆结果；图4全长启动子转基因植株不同组织器官的GUS组织化学分析；图5全长启动子转基因植株不同组织器官GUS基因的定量表达分析；图6各分段缺失启动子转基因植株不同组织器官的GUS组织化学分析；图7各转基因植株在25μM亚砷酸盐胁迫处理3天时不同组织器官的GUS组织化学分析；图8各转基因植株在25μM亚砷酸盐胁迫处理3天时不同组织器官的GUS基因的定量表达分析；图9在CaMV35::GUS和pQ528Q::GUS转基因植株不同组织器官中GUS酶活性的比较分析。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步说明：以下实施例中所采用的实验材料主要包括：(a)植物材料：粳稻品种日本晴(OryzasativaL.japonica)；(b)菌株和载体：大肠埃希氏菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105均为市售商品；载体pGEM-T购自Promega公司；表达载体pCX-GUS-P由浙江省农科院病毒与生物技术研究所张恒木课题组提供；(c)酶和化学试剂：限制性内切酶XcmI购自NEB公司；ExTaq购自TaKaRa公司；cDNA反转录试剂盒ReverTraAceqPCRRTKit、定量表达分析试剂盒购自TOYOBO公司；DNAMarker购自北京全式金公司；T4DNALigase、凝胶回收试剂盒购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自康为试剂有限公司；Trizol购自Invitrogen公司；CTAB等其他常规生化试剂购自杭州奥谦生物科技有限公司。以下实施例中，PCR引物合成和DNA测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。以下实施例中所述的ABI7900实时荧光定量PCR仪购自AppliedBiosystems公司；体式显微镜AF6000购自莱卡公司；酶标仪SpectraMaxM5购置MolecularDevices公司。以下实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法或按照制造厂商的使用说明进行。实施例1：水稻MIR528基因启动子的克隆1.1实验方法1.1.1MIR528基因启动子的预测根据MSUv7数据库中水稻基因组注释信息，编写PERL程序提取MIR528前体序列上游2Kb核苷酸序列。利用Promoterv2.0、TSSP等启动子在线预测工具对相应核苷酸片段进行分析，以明确其是否为可靠的启动子序列。1.1.2MIR528基因启动子的克隆与生物信息学分析采用CTAB法提取水稻基因组DNA。根据预测的MIR528启动子序列设计特异引物(Forward：5’-TCATCTCAAACTGTCATAGACC-3’，Reverse：5’-GTCGCTGCTACAGCCAAAAAG-3’)，以基因组DNA为模板进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻MIR528基因启动子，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种水稻MIR528基因启动子，其特征是：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种表达载体，其特征是：含有权利要求1所述的启动子。3.一种宿主菌，其特征是：含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆坡，胡海超，张恒木，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33