肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及一种肺炎支原体快速检测试剂盒及使用方法。其中试剂盒内包括环介导恒温扩增反应管、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶；反应管中含有反应缓冲液、ｄＮＴＰ、硫酸镁、引物１：５－ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＧ－３、引物２：５－ＴＡＣＣＧＧＣＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧ－３、引物３：５－ＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＴＴＡＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧ－３、引物４：５－ＡＣＡＧＣＧＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣ－３、甜菜碱、氯化锰和钙黄绿素。检测肺炎支原体的方法包括待测样品或细菌ＤＮＡ的提取、肺炎支原体的环介导恒温扩增反应和显色检测。本发明专利技术具有检测准确、灵敏度高、特异性强、简便、快速的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用环介导恒温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的 方法，具体是一种肺炎支原体快速检测试剂盒(L旭P)及使用方法。
技术介绍
肺炎支原体(MP)是入类支原体肺炎的病原体，是引起儿童呼吸道感染及 非典型肺炎的主要病原体之一。1/3以上的非细菌性肺炎都是由MP引起的， MP同时是社区获得性肺炎的重要病原体，人群密集的地方感染率高达50%。 快速、准确的检测肺炎支原体是有效防止肺炎支原体感染的前提条件。目前 临床上肺炎支原体的鉴定通常还是利用传统的生理生化方法进行鉴定，但由 于肺炎支原体对培养要求高及培养时间长(通常需要3 4天)，需要消耗大量 的人力和物力，现在已经越来越无法满足临床诊断发展的要求。随着分子生物学的发展，临床诊断技术中已从传统的生化鉴定向分子生物 学方法如PCR、探针杂交等技术发展。PCR检测方法灵敏度高、特异性强，但 PCR法需昂贵的设备，操作复杂且对实验室的环境要求较高，检测费用亦较 高，致临床无法普及。环介导恒温扩增技术(简称LAMP)是2000年开发出的一种新的核酸扩增 技术，它利用B"大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内 引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别耙序列上的6个独立区 域。LAMP在恒温(65")的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧 光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。L細P具有简 单、快速、特异性强的特点，能代替PCR方法的最新技术。现已被广泛应用 于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域。如何运用环介导恒温扩增技术检测临 床肺炎支原体在临床诊断技术发展中具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP)的制备和 使用方法，以提高肺炎支原体的诊断效率，节约时间，解决传统检测方法无 法满足临床诊断的发展要求，本专利技术通过无数次的试验检测，终于探索出一 种运用环介导恒温扩增技术检测临床肺炎支原体的方法，该方法具有检测快 速、便捷、低成本等特点。本专利技术的主要原理是利用BW大片段DNA聚合酶和根据不同耙序列设计 的两对特殊的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列 上的6个独立区域。其扩增原理是FIP引物杂交在目标DNA的F2C区段， 启动互补链合成，导致DNA哑铃状结构的产生。此哑铃状结构很快以自身为 模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，该茎-环结构是LAMP法基因 扩增循环的起始结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延 伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形 状的茎一环结构的DNA，数量级可达109。 LAMP在恒温(65"C)的条件下反应1 小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的 反应结果。本专利技术涉及的肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP),其中的试剂包括如下: (1)环介导恒温反应管包括lOXThermoPol反应缓冲液、5-lOpmol的引物1、 5-lOpmol的引物 2、 20-40pmo1的引物3、 20-40pmol的引物4、 1.4-1. 6画1/L的dNTP、 4-6mmol/L的硫酸镁、0. 8-1. 2mol/L的甜菜碱、0. 4-0. 5mmol/L的氯化锰和 25-50pmol/L的钙黄绿素；其中，lOXThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸、lOOmM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁和1%的曲拉通 X-100;其中所述dNTP中含有的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的质量比为1:1:1:1 其中所述弓l物1为5-accctcgggggcagtcag-3; 所述弓l物2为5-ctgattgtccctgctggtcc-3;所述弓(物3为'.5-gttcagagctggaggttggctttttcgatgattacaggcggttc-35所述弓l物4为5-gggcggggtgaaggaatgatattttctcgtgaact1:ggtgtgg1:-3;(2) Bst DNA聚合酶8U/uL。上面所述环介导恒温扩增反应管中每管22ii L反应液的最佳组成为2. 5 PL lOXThermoPol反应缓冲液、luL 10pmo1/u L的引物1、 luL 10pmo1/ uL的引物2、 luL40pmol/nL的引物3、 1 u L 40pmo1/u L的引物4、 3.5 yL 10腿ol/L dNTP、 luL 100mmol/L硫酸镁、5uL 5mol/L甜菜碱、luL 12. 5咖ol/L氯化锰、1 u L 625 u mol/L ,丐黄绿素和4 u L的无菌双蒸水。 使用上述试剂盒快速检测肺炎支原体的方法，依次包括下列步骤(1)待检样品DNA提取A、 取200u L待检样品或100 U L菌培养液置于1. 5mL无菌离心管中，加入600 uL悬浮液(15%Chelexl00树脂、100画1/L Tris-HCl pH8.0、0. lmmol/L EDTA、 0. 1%叠氮钠)，振荡器上充分混匀30秒；B、 于沸水浴中煮沸10分钟，后于冰上迅速冷却；C、 放入离心机10000转/分钟离心5-10分钟，取上清到无菌离心管中， 即为待检模板DNA。(2) 肺炎支原体的环介导恒温扩增反应A、 在装有22 u L LAMP反应液的反应管中加入2 u L待检样品模板DNA和 luL Bst DNA聚合酶；B、 于恒温水浴箱或金属浴中60-65'C放置45-90分钟；C、 于80-95。C放置3-5分钟中止反应，取出观察结果；(3) 结果观察取出反应管，直接用肉眼观察颜色变化，若颜色为绿色，说明待检样品 或菌液含有或者是肺炎支原体，若颜色为橙色，则说明样品或菌液不含有肺 炎支原体。本专利技术的有益效果是本试剂盒根据肺炎支原体的Pl基因序列为肺炎支原体各不同菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不用来源的肺炎支原体的可靠性。本专利技术采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术灵敏度高、特 异性强，不需要昂贵的仪器设备，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结 果观察直观、简便快速。可用于肺炎支原体的检测，特别适用于临床快速检具体实施例方式下列实施实例不说明本专利技术，但不应当作对本专利技术的限制。按下列配方制作肺炎支原体快速检测试剂盒(LAMP): (1) LAMP反应管含有2. 5uL 10XThermoPol反应缓冲液、1 w L 10 u mol/L引物1、 U L10"mol/L引物2、 1pL 40ymol/L弓f物3、 luL 40ymol/L引物4、 3.5 u L 10mmol/L認TP、 1 u L 100ramol/L硫酸镁、5 u L 5mol/L甜菜碱、1 u L 12. 5 mmol/L氯化锰、1pL 625umol/L钙黄绿素、4iiL无菌双蒸水。其中，10 XThermoPol反应缓冲液含有200慮pH8. 8的三羟基甲基氨基甲焼-盐酸、 lOOmM的氯化钾、100mM的硫酸铵、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎支原体快速检测试剂盒，其特征在于，其中的试剂包括：　　（１）环介导恒温反应管：　　包括１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液、５－１０ｐｍｏｌ的引物１、５－１０ｐｍｏｌ的引物２、２０－４０ｐｍｏｌ的引物３、２０－４０ｐｍｏｌ的引物４、１．４－１．６ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、４－６ｍｍｏｌ／Ｌ的硫酸镁、０．８－１．２ｍｏｌ／Ｌ的甜菜碱、０．４－０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化锰和２５－５０μｍｏｌ／Ｌ的钙黄绿素；　　其中，１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液含有２００ｍＭ　ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍＭ的氯化钾、１００ｍＭ的硫酸铵、２０ｍＭ的硫酸镁和１％的曲拉通Ｘ－１００；　　其中所述ｄＮＴＰ中含有的ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ的质量比为１∶１∶１∶１　　其中所述引物１为：５－ａｃｃｃｔｃｇｇｇｇｇｃａｇｔｃａｇ－３；　　所述引物２为：５－ｃｔｇａｔｔｇｔｃｃｃｔｇｃｔｇｇｔｃｃ－３；　　所述引物３为：５－ｇｔｔｃａｇａｇｃｔｇｇａｇｇｔｔｇｇｃｔｔｔｔｔｃｇａｔｇａｔｔａｃａｇｇｃｇｇｔｔｃ－３；　　所述引物４为：５－ｇｇｇｃｇｇｇｇｔｇａａｇｇａａｔｇａｔａｔｔｔｔｃｔｃｇｔｇａａｃｔｔｇｇｔｇｔｇｇｔ－３；　　（２）Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶：８Ｕ／μＬ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宜峰，曾冰冰，胡荣，刘义江，
申请(专利权)人：珠海市银科医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]