使用可裂解引物寡核苷酸大小测定制造技术

一种确定引物延伸产物大小的方法，包括： （ａ）将引物与靶核酸杂交，其中所述引物（ｉ）与所述靶核酸互补；（ｉｉ）具有含有引物５’末端的第一区，和（ｉｉｉ）具有含有引物３’末端的第二区，其中所述３’末端可作为酶促延伸的引发位点，而所述第二区含有一可裂解位点， （ｂ）酶促延伸引物以产生由引物和延伸片段组成的混合物； （ｃ）在可裂解位点裂解以释放延伸片段；和 （ｄ）用质谱确定延伸片段的大小，其中相对于产物（ｂ）的阅读长度，延伸片段的阅读长度有所增加。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含可裂解引物的寡核苷酸组合物，以及使用所述引物的诊断和分析方法。参考文献Agrawal，S.，and Goodchild，J.，四面体通讯.283539-3542(1987)Ausubel，F.M.，et al.，分子生物学中的现有方法，John Wiley andSons，Inc.，Media PA(1988)Bannwarth，W.，等，DNA 5413(1986).Bannwarth，W.，Chimia 41302(1987).Bannwarth，W.，瑞士化学学报711517-1527(1988).Bischoff，R.，等，分析生物化学164336-344(1987).Collins，S.J.，等.，科学22572(1984).Cormier，J.，等，核酸研究.164583-4594(1988).Corey，E.J.，and Snider，B.B.，美国化学会志942549-2550(1972)Cosstick，R.等.，化学会志化学通讯992(1988)Cosstick，R.，等.，四面体通讯.30(35)4693-4696(1989).Daley，G.Q.，等.，美国国家科学院院报859312-9316(1988).Dattagupta，N.，美国专利号4,818,681(1989).Erlich，H.A.，PCR技术，Stockton，New York(1989)Fodor，S.P.A.，等，科学251767-773(1991)Gale，R.P.，等.，美国国家科学院院报815648(1984)Ghosh，S.，等.，核酸研究155353-5372(1987)Gingeras，T.，等.，核酸研究155373-5390(1987)Glazer，A.，等.，自然359859-861(1992)Goldkorn，T.，等.，核酸研究14(22)9171-9191(1986)Green，N.M.，蛋白质化学进展(Avidin，Ed.)Academic Press，New York，NY，U.S.A.，p.29，85-133(1975).Gromova，E.S.，生物有机化学13269(1987).Gyllensten，U.B.，生物技术7700(1989).Hasa，T.，等化学通讯601(1976).Hegner，M.，等.，FEBS通讯336452-456(1993a).Hegner，M.，等.，表面科学29139-46(1993b).Hillenkamp，R.，质谱学进展11A354-361(1988).Hobbs，J.B.，有机磷化学21201-321(1990).Innis，M.A.，et.al.，PCR方法，Academic Press，San Diego(1990)Khrapko，K.，et al.，DNA序列1375-388(1991)Koole，L.H.，et al.，Proc.K.Ned.Akad Wet.B91205-209(1988).Kremsky，J.，et al.，核酸研究152891-2909(1987).Kusukawa，N.，et al.，生物技术966(1990).Longo，M.C.，et al.，基因93125(1990)Mag，M.，et al.，核酸研究19(7)1437-1441(1991)Maniatis，T.，et al.，分子克隆实验室手册Cold Spring HarborLaboratory(1982).Maskos，U.，et al.，核酸研究20(7)1679-1684(1992).McBride，L.J.，et al.，四面体通讯24245(1983)Miller，P.S.，et al.，美国化学会志936657-6665(1971).Moody，H.M.，et al.，核酸研究124769-4782(1989)Mullis，K.B.，et al.，美国专利号4,683,195，issued 28 July 1987Mullis，K.B.，美国专利号4,683,202，issued 28 July 1987.Nadji，S.，et al.，美国化学会志1149299-9269(1992)Nakamaye，K.I.，et al.，核酸研究169947-9959(1988)Nelson，R.W.，et al.，科学2461585-1587(1989).Ogilvie，K.，et al.，四面体通讯264159-4162(1986)Olsen，D.，et al.，酶学方法.21879-92(1993).Olsen，G.J.，et al.，核酸研究.202199(1992)Primings，et al.，酶学方法65561-580(1980).Saha.A.，et al.，有机化学杂志587827-7831(1993)Sanger，F，分子生物学杂志94441-448(1975)Saiki，R.K.，et al.，美国国家科学院院报，866230-6234(1989).Schmidt.T.M.，et al.酶学方法235205-222(1994)Seliger，H.，et al.，核苷核苷酸6483-484(1987).Southerm，et al.，基因组学131008-1017(1992).Sproat，B.S.，et al.，核酸研究154837(1987).Szczylik，C.，et al.，科学253562-565(1991).Szybalski，W.，基因40169-173(1985).Tomasz.J.，et al.，四面体通讯223905-3908(1981).Townsend，L.B.，et al.，Eds，核酸化学改进的和新的合成过程、方法和技术John Wiley and Sons，New York，NY.pp.337(1986).Van Ness，J.et al.，核酸研究193345-3350(1991).Wu，K.J.，et al.，质谱学快报7142-146(1993).Watson，J.D.，et al.，重组DNA第二版Scientific American，Inc，Chapter27(1992)Yamamoto，I.，et al.，化学会志，Perkin Trans.l1306(1980)Youngquist，R.S.，et al.，质谱学快报877-81(1994)Zhang，Y.，et al.，核酸研究193929-3933(1991)专利技术背景DNA，主要的遗传物质，是由两条缠绕在一起的多核苷酸链组成的复杂分子，每个核苷酸含有一个脱氧核糖单位，一个磷酸基和一个含氮杂环碱基。两条多核苷酸链经互补碱基对之间的氢键作用而结合在一起。正常人有23对染色体，共含有约100,000个基因。人染色体中所含DNA的长度总共约33亿个碱基对，一个基因通常含有约30,000个碱基对。由于在人和非人基因组中尚有大量遗传信息未被收集到，因此正在尽力开发新的更迅速的方法以完成DNA检测、大小测定、定量分析、测序和包括人疾病基因作图的基因鉴定。尽管自动化已经提高了这些过程的效率，但仍需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种确定引物延伸产物大小的方法，包括(a)将引物与靶核酸杂交，其中所述引物(i)与所述靶核酸互补；(ii)具有含有引物5’末端的第一区，和(iii)具有含有引物3’末端的第二区，其中所述3’末端可作为酶促延伸的引发位点，而所述第二区含有一可裂解位点，(b)酶促延伸引物以产生由引物和延伸片段组成的混合物；(c)在可裂解位点裂解以释放延伸片段；和(d)用质谱确定延伸片段的大小，其中相对于产物(b)的阅读长度，延伸片段的阅读长度有所增加。2.权利要求1的方法，其中所述靶核酸是被固定的。3.权利要求2的方法，其中在所述延伸前所述靶核酸被固定。4.权利要求2的方法，其中在所述裂解前固定所述靶核酸。5.权利要求1的方法，其中所述可裂解位点是能够阻断5’向3’酶促消化的核苷酸，而其中通过用具有5’向3’外切核酸酶活性的酶消化引物第一区来完成所述裂解。6.权利要求1的方法，其中所述可裂解位点位于所述引物3’末端的约5个核苷酸处或在约5个核苷酸内。7.权利要求6的方法，其中所述引物的第二区也是含有可裂解位点的单核苷酸。8.权利要求7的方法，其中所述第二区是核糖核苷酸。9.权利要求1的方法，其中所述可裂解位点选自二烷氧基硅烷、3’-(S)-硫代磷酸酯、5’-(S)-硫代磷酸酯、3’-(N)-氨基磷酸酯、5’-(N)-氨基磷酸酯、尿嘧啶和核糖。10.权利要求1的方法，其中用于步骤(b)中引物延伸的酶是DNA聚合酶。11.权利要求1的方法，其中用于步骤(b)中引物延伸的酶是连接酶。12.权利要求4的方法，其中还包括在所述裂解步骤前，从所述固定靶核酸中分离(b)的产物。13.权利要求1的方法，其中所述大小测定法是飞行时间质谱。14.权利要求1的方法，其中所述延伸是在含(i)固定化连接位点和(ii)可释放位点，其中所述延伸片段包含所述固定化连接位点和所述可释放位点。15.权利要求14的方法，还包括在所述大小测定前，在固定化连接位点固定所述延伸片段和在所述可释放位点释放所述延伸片段。16.一种确定引物延伸产物大小的方法，包括(a)将引物与靶核酸杂交，其中所述引物(i)与所述靶核酸互补；(ii)具有含引物5’末端，及固定连接位点的第一区和(iii)具有含有引物3’末端的第二区，其中所述3’末端可作为酶促延伸的引发位点，而所述第二区含有一可裂解位点，(b)酶促延伸引物以产生由引物和延伸片段组成的混合物；(c)在可裂解位点裂解以释放延伸片段，其中在所述裂解前，在所述固定化连接位点固定所述引物；和(d)用质谱确定延伸片段的大小，其中相对于产物(b)的阅读长度，延伸片段的阅读长度有所增加。17.权利要求16的方法，其中所述可裂解位点位于所述引物3’末端的约5个核苷酸处或在约5个核苷酸内。18.权利要求17的方法，其中所述引物的第二区是也含有可裂解位点的单核苷酸。19.权利要求18的方法，其中所述第二区是核糖核苷酸。20.权利要求16的方法，其中所述可裂解位点选自二烷氧基硅烷、3’-(S)-硫代磷酸酯、5’-(S)-硫代磷酸酯、3’-(N)-氨基磷酸酯、5’-(N)-氨基磷酸酯、尿嘧啶和核糖。21.权利要求16的方法，其中用于步骤(b)中引物延伸的酶是DNA聚合酶。22.权利要求16的方法，其中用于步骤(b)中引物延伸的酶是连接酶。23.权利要求16的方法，其中还包括在所述裂解步骤前洗涤已被固定的产物。24.权利要求16的方法，其中所述大小测定是通过基质辅助激光解吸离子化质谱来完成的。25.权利要求24的方法，其中所述大小测定是通过飞行时间质谱。26.权利要求24的方法，其中在所述大小测定前，将所述延伸片段包埋在化学基质中。27.权利要求16的方法，其中将所述引物通过连接在键合于固体支持物上的间隔臂的固定化连接位点上而固定在固体支持物上。28.权利要求27的方法，其中所述间隔臂的长为6或更多个原子。29.权利要求16的方法，其中所述固定化连接位点在引物的碱基或糖上作为取代基。30.权利要求16的方法，其中所述固定化连接位点是生物素或地高辛配基。31.权利要求16的方法，其中将所述引物固定在选自玻璃、硅、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银和金的固体支持物上。32.权利要求16的方法，其中引物的固定化连接位点是由一系列与中介寡核苷酸互补的碱基组成，其中通过固定化连接位点与结合于固体支持物上的中介寡核苷酸的特异性杂交来固定所述引物。33.一种确定引物延伸产物大小的方法，包括(a)在促进引物与核酸杂交的条件下，将第一和第二引物与靶核酸组合，产生引物/核酸复合物，其中所述第一引物(i)有5’末端和3’末端(ii)与所述靶核酸互补；(iii)具有含有第一引物5’末端的第一区，和(iv)具有含有第一引物3’末端的第二区，其中所述3’末端可作为酶促延伸的引发位点，而所述第二区含有一可裂解位点，而其中所述第二引物(i)有5’末端和3’末端(ii)与所述靶核酸同源，(iii)具有含有第二引物3’末端的一个片段，和(iv)具有含有第二引物5’末端和固定化连接位点的第二片段，(b)在DNA聚合酶和脱氧核苷三磷酸的存在下，将引物/核酸复合物转变成双链片段，(c)通过连续重复下列步骤扩增含引物的片段(i)将所述双链片段变性以产生单链片段，(ii)将所述单链片段于所述第一和第二引物杂交以形成链/引物复合物，(iii)在DNA聚合酶和脱氧核苷三磷酸的存在下，由链/引物复合物产生扩增产物，和(iv)重复步骤(i)-(iii)直到得到所需的扩增程度，(d)经所述固定化连接位点固定含第二引物的扩增产物，(e)除去未被固定的扩增片段，(f)在可裂解位点裂解所述扩增产物以得到含双链产物的混合物，(g)将双链产物变性以释...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·蒙福尔特，C·H·贝克尔，T·A·沙勒尔，D·J·波拉尔特，
申请(专利权)人：斯里国际，
类型：发明
国别省市：