一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异的引物组合物及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异的引物组合物及试剂，所述引物组合物可通过多重PCR的方法在单管中特异性地扩增SMN1和SMN2基因所有外显子和部分内含子或UTR毗邻区，建成的文库随后用于NGS测序，从而实现对患者SMN1、SMN2基因的整体拷贝数和第7、8外显子各自拷贝数变异的报告，同时也可以报告这两个基因其他区域的致病点突变和短缺失/插入突变。本发明专利技术可满足SMA致病基因筛查，遗传风险分析，病症预后评估，治疗指导等的需要，整体流程简单高效，成本低，具有良好的前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
析点突变。MLPA技术是目前检测SMA拷贝数的金标准，但无法检测未知的点 突变，且整体操作较为繁琐。相比之下，NGS技术既可以检测点突变，又可以 检测SMN1/2的拷贝数变异，而且测序通量很高，适用于广泛人群的自动化普 筛，具有很好的应用潜力，但同时也对用于SMA基因检测的NGS引物/探针组 的设计能力提出了较高的要求。

技术实现思路

[0006]因此，为了解决上述不足，本专利技术在此提供一种基于NGS方法检测人类 SMN1和SMN2基因变异的引物组合物及其应用，用于人类脊髓性肌萎缩症 (SMA)敏感基因SMN1和SMN2的分子检测，检测内容包括全部外显子区域 的点突变(SNV)和短插入/缺失(in_del)，SMN1&2整体的拷贝数变异(CNV)， 以及SMN1/2这两个基因第7、8号外显子各自的拷贝数变异情况。检测结果可 满足SMA致病基因筛查，遗传风险分析，病症预后评估，治疗指导等的需要。
[0007]本专利技术是这样实现的，本专利技术提供一种用于SMN1和SMN2基因检测的引 物组合物，包括48对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与 反向引物序列均包括3
’
端的基因特异性扩增区域，以及与所述特异性扩增区域 5
’
端连接的接头匹配区域。
[0008]本专利技术所述的引物组合物共计48对，又分为两组：第一组引物为22对， 可特异性扩增SMN1/SMN2基因全部外显子区域，以及第7、8外显子周边的部 分内含子或UTR区域，其中的正向引物3
’
端特异性扩增区域序列分别如SEQ ID1～22所示，反向引物的3
’
端特异性扩增区域序列分别如SEQ ID 23～44所示； 第二组引物为26对，可特异性扩增人类基因其他特定区域的序列，作为SMN1/2 基因拷贝数变异的参照，其中的正向引物3
’
端特异性扩增区域序列分别如SEQID 45～70所示，反向引物的3
’
端特异性扩增区域序列分别如SEQ ID 71～96所 示。
[0009]此外，上述48对引物中正向引物的5
’
端接头匹配区域序列如SEQ ID NO.97 所示，反向引物的5
’
端接头匹配区域序列如SEQ ID NO.98所示。
[0010]该引物组合物可通过多重PCR方法建立文库，随后文库NGS测序的手段来 检测受试者SMN1和SMN2基因所有外显子区域和部分重要的内含子或UTR毗 邻区，以及人类基因组中多个参考位点。可测的突变类型包括点突变、短插入/ 缺失、和拷贝数变异。其中拷贝数变异的结果既包括SMN1&2整体的拷贝数扩 增/缺失，也包括至关重要的SMN1和SMN2基因第7、8号外显子各自的变异 情况。该引物组合物的整体设计使得所有对目的片段的扩增和后续的文库构建 可在同一管中进行，避免了分管的麻烦，节省了相关物料和时间，整体成本较 低。
[0011]优选的，上述正向引物与反向引物中的特异性扩增区域序列为所述SEQ ID1～96其中的18
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25个碱基序列。
[0012]优选的，上述正向引物与反向引物中的接头匹配区域序列为所述SEQ ID97～98其中的20
‑
25个碱基序列。
[0013]本专利技术进一步保护一种上述的SMN1和SMN2基因变异检测引物组合物在 SMA遗传风险分析和治疗潜在获益对象筛选中的应用。
[0014]本专利技术进一步保护一种用于SMN1和SMN2基因变异检测的试剂，包括上 述的引物组合物。
[0015]优选的，还包括三对接头中的至少一对，所述三对接头分别对应Illumina、 Ion Torrent、MGI三种测序平台，所述接头内部含有与SEQ ID 97～98所述序列 配对的DNA片段。
[0016]优选的，所述试剂适用于新鲜或冰冻组织、全血、白细胞、唾液的基因组 DNA样本的分子检测。
[0017]本专利技术进一步保护一种上述的试剂在基于NGS方法的SMN1和SMN2基因 检测中的应用。
[0018]本专利技术具有如下优点：本专利技术通过改进在此提供一种基于NGS方法检测人 类SMN1和SMN2基因变异的引物组合物及其应用，与同类型设备或试剂相比， 具有如下改进：
[0019]优点1：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，所述的引物组合物，在重要位点均采取两条扩增子“双 重覆盖”的设计，可有效地检测人类SMA敏感基因SMN1和SMN2上与疾病 发生、发展密切相关的SMN1/2第7、8号外显子各自的拷贝数变异情况。
[0020]优点2：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，并未简单地将SMN1/2各自的拷贝数默认为2，而是通 过基因组参考位点的对比，考虑SMN1&2发生整体扩增或缺失的可能性。因此 可以提示“2+1”，“2+2”等特殊情况，为受试者提供精确的SMN1和SMN2 基因拷贝数变异图谱。
[0021]优点3：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，该引物组合物还可以检测SMN1/2基因的全部外显子 区域的点突变和短插入/缺失。结合上述第1
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2点，该引物组合物的检测结果可 满足SMA致病基因筛查，遗传风险分析，病症预后评估，治疗指导等的需要。
[0022]优点4：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，试剂构建文库时为单管反应，操作简单便捷，可在数 小时内完成NGS文库构建。测序需要的数据量低，结果的比对率、中靶率和均 一度都较好。
[0023]优点5：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，试剂适用于来自受试者的新鲜或冰冻组织、外周血白 细胞DNA、唾液DNA、FFPE等多种类型样本的检测，且对样本的要求较低。 单次反应的常规样本输入量为20ng，通过优化实验可进一步低至5
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10ng。
[0024]优点6：本专利技术所述一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异 的引物组合物及其应用，涉及方法简单，总体成本低，填补了国内SMN1和SMN2 基因检测领域多重PCR技术构建NGS文库的空白，有助于实现试剂从实验室向 临床应用和体外诊断试剂的转化，具有良好的应用前景。
附图说明
[0025]图1为根据本专利技术的基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异的 引物组合物中单条引物的结构示意图；
[0026]图2
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图16是本专利技术实施例中，对样品SMA
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01～15检测结果示意图。
具体实施方式
[0027]下面将对本专利技术进行详细说明，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于NGS方法检测人类SMN1和SMN2基因变异的引物组合物，其特征在于，包括：22对第一组引物，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括可特异性扩增SMN1/SMN2基因外显子、内含子或UTR区域的序列，上述特异性序列包括SEQ ID NO.1～44所示的序列，为其中18
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25个碱基。2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，还包括26对的第二组引物，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括可特异性扩增人类基因中特定参考区域的序列，上述特异性序列包括SEQ ID NO.45～96所示的序列，为其中18
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25个碱基。3.如权利要求1、2所述的引物组合物，其特征在于，每对引物的正向引物均包括SEQ ID NO.97所示的序列，为其中20
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25个碱基。4.如权利要求1、2所述的引物组合物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋钢，王朝晖，王强，
申请(专利权)人：上海真固生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：