一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物及其应用，属于基因检测技术领域。在胚胎移植前检测领域和产前诊断领域中，由于扩增不均一导致的脱扣现象等的技术局限性以及发育生物学特点的客观存在、诊疗需求的快速发展要求我们能够高效方便低成本的检测到0.01％含量的PKD1致病突变，同时排除其假基因以及高GC含量的干扰。本发明专利技术针对这一需求提供了一种灵敏度达到0.001％的PKD1真基因变异信息的方法和试剂盒，不仅适合于常规样本的检测，而且更适合于单细胞级别样本、单细胞扩增样本、游离DNA样本的检测，提供了允许对PKD1真基因一个或多个外显子进行选择性扩增的特异性引物和试剂盒。异性引物和试剂盒。异性引物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物及其应用。

技术介绍

[0002]常染色体显性遗传性多囊肾(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)是一种常见的迟发性系统疾病，其发病率为1/1000
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1/400。随着ADPKD的发展，到60岁时，多达50％的患者会发展为终末期肾病(End
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Stage Kidney Disease，ESKD)。因此，ADPKD是ESKD最常见的原因之一。在已报道的ADPKD的病例中，发现致病突变分别为PKD1(78％)、PKD2(15％)、GANAB(0.3％)和NAJB11(0.1％)，此外，还有约7％为未知的遗传因子。ADPKD的诊断主要通过肾的影像学来确定，但是该病在新生儿中通常没有临床症状，因此得到诊断的患者估计不到1/2。
[0003]PKD1基因位于16号染色体(16p13.3)，包含约52000bp。其中14148bp的46个外显子编码4304个氨基酸。由于16号染色体的重排现象，导致16p在16p13.1产生了与PKD1基因高度同源的区域。Bogdanova等人的研究表明，这些高度同源的区域，均为PKD1的假基因。最近的研究表明，虽然PKD1基因将近三分之四的区域(1
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33号外显子)存在基因序列相似程度高达97.7％的6条假基因，但是在不同的外显子区域，他们的假基因的占比从14％～33％不等。PKD1基因结构的复杂性，除了具有高度同源的假基因以外，1号外显子的GC含量也高达85％。
[0004]由于假基因与高GC区域的存在，常规的检测方法对于PKD1基因的基因检测存在诸多的障碍。目前，主流的分析方法，是使用长距离聚合酶链式反应(Long
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Range PCR，LR
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PCR)结合下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)的方法，对PKD1基因进行检测。NGS技术具有高通量、快速、和成本低的优点，可以实现对多个样本、多个基因同时检测。但是，NGS技术在对高GC的区域不能很好的得到有效的数据。此外，由于NGS的读序较短，很难区分PKD1基因和其假基因。与此同时，Sanger测序是确定致病基因突变的金标准，仅使用NGS技术，无法提供准确的测序结果，无法完全满足临床的实际需求。
[0005]人口增速变缓已经成为现状，随着三胎政策的落实，优生优育的国策得到进一步加强，男女高龄等因素导致胎儿新发突变比例升高现象突显，辅助生殖、产前诊断技术成为重要的解决生育困难和优生优育的有力手段，占所有生育解决方案的50％以上，辅助生殖技术中涉及到对胚胎的筛选等环节，需要利用单个或者少量细胞及其扩增产物进行致病位点的鉴定，目前使用的单细胞全基因组扩增技术会造成等位基因脱扣现象，即，在基因组中呈现杂合的位点经过全基因扩增后，严重偏离50％:50％的比例关系，呈现出0.01％～99.99％:99.99％～0.01％的关系，具体表现在PKD1基因上，可以描述为，由于6个假基因的存在，原始基因组样本中，PKD1真基因杂合位点中致病基因型的比例1/7*50％＝7％，又由于全基因扩增脱扣现象的存在，具体呈现出0.01％～99.99％:99.99％～0.01％的比例关系，传统的LR
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PCR联合NGS的技术已经检测不到这样的比例，造成误诊；另一种胚胎移植前
单基因病遗传连锁检测技术虽然能在一定程度上克服脱扣现象造成的困扰，但由于需要制定单倍型家系谱图，会导致检测成本高昂、最多浪费一半的胚胎等结果；在胚胎筛选环节之后，胚胎移入子宫发育，传统的无创检测也无法很好进一步确定胎儿是否含有PKD1有害突变，具体表现为母体外周血游离DNA中通常含有5～10％的胎源游离DNA，PKD1真基因致病基因型比例从7％下降至0.35％～0.7％，此时，传统的LR
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PCR联合NGS的技术和遗传连锁检测技术无法使用，只能进行羊水穿刺在产前进一步确定胎儿是否含有PKD1真基因致病突变，羊水穿刺是一种手术，具有2％
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5％的流产风险，给患者家庭带来较大的经济和精神压力。
[0006]综上所述可以看到，在胚胎移植前检测领域和产前诊断领域中，由于技术局限性以及发育生物学特点的客观存在，现实要求我们能够高效方便低成本的检测到0.01％含量的PKD1致病突变，同时排除其假基因以及高GC含量的干扰。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种能够稳定检测到0.01％、灵敏度达到0.001％的PKD1真基因变异信息的试剂盒，不仅适合于常规样本的检测，而且更适合于单细胞级别样本、单细胞扩增样本、游离DNA样本的检测。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物：
[0009]所述引物为扩增人类PKD1基因1
‑
33号任意一个或多个外显子的上游引物和下游引物；
[0010]所述探针覆盖一个或多个PKD1真假基因碱基差异位点；
[0011]在0.25mol/L盐浓度、55℃下：
[0012]所述探针的吉布斯自由能ΔG符合
‑
20.7073kcal/mol≤ΔG≤
‑
44.6782kcal/mol；
[0013]所述上游引物的吉布斯自由能ΔG符合
‑
15.1985kcal/mol≤ΔG≤
‑
19.5029kcal/mol；
[0014]所述探针和上游引物的吉布斯自由能之差ΔΔG在
‑
3.6107
×
N/Tr范围内，其中，N为54～457的整数，Tr为PCR循环的退火温度。
[0015]进一步地，所述探针的序列如下：
[0016][0017][0018]其中X1为CCC、CCCG、CGGG、CGCG、GCGG、GGCG、GGGG、CCGC、CCCC、GCGG、GGG、CGCC、GGCC、GGTT、GGC、GGT、CCG、CGC、GGGC、CCTT、GCG中的一种。
[0019]进一步地，所述上游引物的序列如下：
[0020][0021][0022][0023]进一步地，所述下游引物的序列如下：
[0024]下游引物名称序列5
’‑3’
PKD1_Exon1_RPCAGGAAACAGCTATGACCGACCTCCAGGCGTTCCTTATTTAGCPKD1_Exon2&3_RPCAGGAAACAGCTATGACCGACGATCTGGTCTCAAGCCTGGAAGPKD1_Exon4&5.1_RPCAGGAAACAGCTATGACCGACACAGGTGGGGGCAGGAGPKD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人类PKD1基因变异的探针和引物组合物，其特征在于：所述引物为扩增人类PKD1基因1
‑
33号任意一个或多个外显子的上游引物和下游引物；所述探针覆盖一个或多个PKD1真假基因碱基差异位点；在0.25mol/L盐浓度、55℃下：所述探针的吉布斯自由能ΔG符合
‑
20.7073kcal/mol≤ΔG≤
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44.6782kcal/mol；所述上游引物的吉布斯自由能ΔG符合
‑
15.1985kcal/mol≤ΔG≤
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19.5029kcal/mol；所述探针和上游引物的吉布斯自由能之差ΔΔG在
‑
3.6107
×
N/Tr范围内，其中，N为54～457的整数，Tr为PCR循环的退火温度。2.根据权利要求1所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述探针的序列如下：
其中X1为CCC、CCCG、CGGG、CGCG、GCGG、GGCG、GGGG、CCGC、CCCC、GCGG、GGG、CGCC、GGCC、GGTT、GGC、GGT、CCG、CGC、GGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：董博昊，罗俊峰，汪进平，谭燕芳，李佳华，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：