一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，所述方法包括以下步骤和完成这些步骤所需的试剂：基因组DNA片段化；DNA末端修补；探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；生物素‑亲和素磁珠分离；以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；PCR扩增；DNA片段长度选择；完成以上各步反应所使用的试剂。与现有的各类靶核酸富集技术相比，本发明专利技术提供的方法具备以下优势：1)保真性好2)重现性好3)速度快4)通用性强。

A method and kit for rapid construction of target nucleic acid sequencing libraries based on probe capture enrichment

The invention discloses a method and a kit for rapid construction of target nucleic acid sequencing library probe capture enrichment based on the method comprises the following steps and reagents required to complete these steps: genomic DNA fragment; DNA terminal repair; single chain DNA fragment probe and thermal denaturation formed by molecular hybridization; biotin affinity by magnetic cell separation; probe based primers for primer extension, complementary strand synthesis; double stranded DNA fragment end connector, the other end is not connected; PCR amplification; DNA fragment length; the completion of the above reaction reagent used. Compared with the existing enrichment technology of various target nucleic acids, the method provided by the invention has the following advantages: 1) good fidelity, 2), good reproducibility, 3), quick speed 4) and versatility.

【技术实现步骤摘要】
一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒
本专利技术属于高通量基因测序
技术背景相对于经典的Sanger测序，高通量基因测序又称二代测序、下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)。相应的，Sanger测序也叫一代测序。全外显子组测序和panel测序都属于靶向基因测序，是二代测序的重要分支技术，主要目的有二：一是为了节省测序费用，因为全外显子组只占全基因组大小的1％，各种panel所针对的目标靶区域更小；二是为了降低生物信息学数据分析的难度，加快分析速度，因而在基础研究、临床科研、临床诊断和新药研发等各领域得到广泛应用。目前已有的外显子测序和靶向测序产品主要有4家品牌：安捷伦公司的SureSelect和HaloPlex，罗氏公司的NimbleGen，Illumina公司的TruSeq和Nextera(基于转座子技术)以及IDT公司的全外显子panel。其中基于转座子的Nextera技术尽管速度快，但是数据质量稍有瑕疵。其他外显子测序技术都包括全基因组文库构建和外显子区域片段捕获富集两个环节，步骤繁多，耗时长；由于反应和纯化的环节较多，导致DNA的损失比较大，因而对模板基因组DNA的量的要求都比较高。对于panel测序，主要有两种技术路线：探针杂交测序和多重PCR扩增子测序。具体选择哪种方法合适，取决于所需检测区域的大小。如果靶区域比较小，2千到3千对引物就能覆盖，通常选择操作比较简便的多重PCR扩增子测序技术；否则，选择流程比较复杂的探针杂交技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，包括两个部分：建库方法和建库试剂盒。本专利技术可以改善目前外显子测序和基因panel靶向测序检测方法的数据质量，降低难度，提高检验速度，可以实现自动化，使高通量基因检验更加快速和准确。本专利技术所采取的技术方案是：一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法，其中方法部分包括以下步骤：1)基因组DNA片段化；2)DNA末端修补；3)生物素标记的探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；4)亲和素磁珠分离探针捕获的DNA片段；5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；6)双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；7)PCR扩增；8)DNA片段长度选择。本专利技术还提出了一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的试剂盒，包括以下试剂：1)酶切消化DNA片段化试剂，或者超声波破碎DNA片段化试剂；2)DNA末端修补试剂；3)探针杂交试剂；4)亲和素磁珠分离试剂；5)引物延伸试剂；6)接头连接试剂；7)PCR试剂；8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂。其中方法部分的以下3个步骤，技术上存在多种可选项，任选其中一种都能实现相同的目的：1)所述的1)基因组DNA片段化，可以用超声波破碎法，也可以用酶切消化法；2)所述的3)探针杂交，探针可以是单链DNA，也可以是单链RNA；3)所述的8)DNA片段长度选择，方法可以用磁珠法，也可以使用琼脂糖凝胶电泳切割法。本专利技术还提供了基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库试剂盒在全外显子组测序和基因panel靶向测序中的应用，包括下述步骤：1)用所述的1)酶切消化试剂，或者超声波破碎试剂，对基因组DNA进行片段化；2)用所述的2)DNA末端修补试剂修补DNA片段的末端；3)用所述的3)探针杂交试剂后进行探针杂交；4)用所述的4)亲和素磁珠分离试剂分离探针所捕获的外显子片段或者靶片段；5)用所述的5)引物延伸试剂进行引物延伸；6)用所述的6)接头连接试剂进行单端接头连接；7)用所述的7)PCR试剂进行PCR扩增；8)用所述的8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂进行DNA片段长度选择。9)对富集得到的外显子或者靶核酸文库进行二代高通量测序；10)对测序结果进行分析，获得受试者的靶核酸基因变异信息。11)本专利技术所提供的新型探针捕获杂交技术，在操作流程的简便性方面达到了扩增子测序的水平，集中了二者的长处，既保持了探针杂交的精密度，又达到了扩增子测序的简便性，而且没有因此增加额外的缺点。12)与现有的各类靶核酸富集技术相比，本专利技术提供的方法具备以下优势：13)1)数据质量高，保真性好。由于PCR循环次数减少1/3，显著降低PCR扩增引入的人为偏差(bias)。14)2)成功率高，重现性好。技术路线简捷明了，反应步骤减少，集中了探针杂交捕获技术的精密度和扩增子测序技术的简便性，把探针杂交测序技术的难度降低到扩增子测序的水平。15)3)速度快。文库构建时间缩短1/3，项目周期缩短。16)4)通用性强。所述方法基于Illumina平台，经过适当优化即可兼容ThermoFisher高通量测序平台和自动化工作站。附图说明图1探针结构示意图。图2接头结构示意图。图3快速靶核酸测序文库构建流程图。具体实施方式实施例1CFTR基因外显子区域富集测序1)基因组DNA片段化超声波破碎和酶切消化两种方法都可以实现满意的基因组DNA片段化效果。本实施案例采用NEB公司的NEBNextdsDNAFragmentase酶切消化方法。1)在0.2mLPCR管中按比例加入下列组分，总体积10μL，稍微涡旋震动混匀3sec，无热盖37℃孵育35分钟；2)在PCR管中加入合适体积的磁珠，稍微涡旋混匀，稍微离心，室温放置5分钟；3)在磁力架上放置5分钟；4)在磁力架上，移除管中的上清液，保留5μL溶液，避免触动磁珠沉淀；5)在磁力架上，加入160μL新鲜配制的80％乙醇，静置30sec，移除160μL洗涤液；6)重复：在磁力架上，加入160μL新鲜配制的80％乙醇，静置30sec，移除160μL洗涤液；7)低速离心30sec，在磁力架上小心移除余液，室温晾干(避免磁珠沉淀开裂)；8)用21μLTE重新悬浮磁珠，吹吸5-6次，室温静置1分钟，置于磁力架上5分钟，将20μL上清液移入新的PCR管中，4℃备用，也可以-20℃保存1周。2.预先将亲和素磁珠M280与生物素标记的CG-p3进行饱和结合，形成CG-M280磁珠，在磁力架上静置5分钟，移去上清，用TE溶液洗涤磁珠沉淀两次，用TE溶液调整浓度为1μg/μL备用，其中CG-p3:5-TCGTGTAGGGAAAGAGTGT-Biotin。3.杂交延伸合成下表中的探针序列，其中的4个N称之为SID以上探针按照等分子数混合形成CG-probemixture，最终调整为0.75fmol/μL按照下列体系配置溶液:纯化后的DNA片段：20μLCG-probemixture(0.75fmol/μL)：3μlNEBuffer2(10X):5μldNTP(10mMeach):0.5μl(0.1mMfinal)SterileH2O:18.5μl混合均匀后，95度5分钟，52度10分钟，降至37度，加入KlenowFragment(3′→5′exo–)(NEBM0212):3μl继续孵育30分钟，然后加入10μlCG-M280磁珠，52度10分钟，置于磁力架上室温放置5分钟，TE溶液洗涤两次。4.连接adaptorCG-p1：5-AGACGTGTGCTCTTCCGATCd本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤和完成这些步骤所需的试剂：1)基因组DNA片段化；2)DNA末端修补；3)探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；4)生物素‑亲和素磁珠分离；5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；6)双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；7)PCR扩增；8)DNA片段长度选择；9)完成以上各步反应所使用的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤和完成这些步骤所需的试剂：1)基因组DNA片段化；2)DNA末端修补；3)探针与热变性形成的单链DNA片段进行分子杂交；4)生物素-亲和素磁珠分离；5)以探针为引物进行引物延伸，合成互补链；6)双链DNA片段一端连接接头，另一端不连；7)PCR扩增；8)DNA片段长度选择；9)完成以上各步反应所使用的试剂。2.根据权利要求1所述的一种基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有：1)酶切消化DNA片段化试剂，或者超声波破碎DNA片段化试剂；2)DNA末端修补试剂；3)探针杂交试剂；4)亲和素磁珠分离试剂；5)引物延伸试剂；6)接头连接试剂；7)PCR试剂；8)磁珠法或者琼脂糖凝胶切割法DNA片段长度选择试剂。3.根据权利要求1所述的基于探针捕获富集的快速构建靶核酸测序文库的方法和试剂盒，其特征在于包括：1)所述的1)基因组DNA片段化，可以用超声波破碎法或者酶切消化法；2)所述的3)探针杂交，其中探针可以是DNA，也可以是RNA，从5’端到3’端，探针依次包含以下4种元件：(a)生物素标记，(b)PCR扩增引物，该序列在后续的高通量测序步骤中也用于与流动槽内表面的寡核苷酸片段杂交，(c)测序引物，(d)靶核酸杂交探针；3)所述的6)接头连接，其中接头包...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云弟，罗俊峰，陈薇，赵萱，柴映爽，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31