一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系及应用、以及基于该体系的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系及应用、以及基于该体系的检测方法，涉及基因检测技术领域。本发明专利技术提供的寡核苷酸体系基于多条寡核苷酸链的竞争机制，在保证目标模板扩增效率的同时，压制非目标模板的扩增，并且还能进一步降低非目标模板引起的非特异性信号，确保超低频率变异信息的特异性。本发明专利技术的寡核苷酸体系能够在检测核酸样本中低至三万分之一的变异信息的同时保证足够的特异性，在检测微小病灶残留时灵敏度可达到MR4.5水平，甚至MR5.0水平。甚至MR5.0水平。甚至MR5.0水平。

【技术实现步骤摘要】
一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系及应用、以及基于该体系的检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系及应用、以及基于该体系的检测方法。

技术介绍

[0002]随着人们对疾病机理的深入认识，迫切要求DNA分子诊断技术朝着灵敏度和特异性越来越高的方向发展，在二代测序(Next Generation Sequencing)
，配合分子标签技术，当DNA投入量足够多、测序深度足够深和成本投入足够多的时候，人们可以检测到万分之一以下、乃至十万分之一以下的变异信息，这些技术可以用在微小病灶残留(Minimal Residual Disease，MRD)这一重要应用领域，MRD现象是指恶性疾病患者，比如癌症患者，在治疗中或者治疗后，体内仍然残留有恶性肿瘤细胞的现象，这种残留会导致复发或者其他不良预后。
[0003]比如，在靶向药治疗白血病的过程中，我们需要用分子学反应(简称MR)，来反应治疗方案的效果。MR是一个数量级概念，用数字来标识，比如MR3.0(这个级别也称主要分子学反应，MMR)，表示白血病细胞下降了3个对数级，残留数量是0.1％；MR4.5，就是白血病细胞下降了4.5个对数级，残留数量是0.0032％；MR5，就是白血病细胞下降了5个对数级，残留数量是0.001％。因此，可以看到MR是表示白血病细胞被清除到什么程度的指标，对用药效果和治疗方案的起到指示的作用，从治疗效果上来说，如果病患转阴，代表着白血病细胞减少到了某一个被医生认可的程度，那么，少到什么程度完全依赖于实验室的检测灵敏度，换句话说，如果某个检测方法的检测灵敏度只能达到MR3.0的水平且被医生认可，那么这个阴性就只能说白血病细胞的残留数量在0.1％以下，如果能达到MR4.5，那么阴性就代表白血病细胞残留数量在0.0032％以下，意味着复发的可能性要比MR3.0小，由此可见，MR值越小，病患痊愈的可能性就越大，越不容易复发，目前国内大多数实验室的检测灵敏度只能达到MR3.0(MMR)的水平，就医生认可的角度上来说，其实临床上非常需要MR4.5水平，甚至MR5.0水平的技术。
[0004]现有的指南和专家共识都明确了临床上需要对MRD残留细胞的进行监控，当前能够进行MRD监控需求的技术主要包括：(1)多参数流式细胞术(MFC)，是一种比较快速、能定量鉴定癌细胞的方法，流式细胞术可以检测血液中的循环肿瘤细胞，其峰值灵敏度为0.01％，即1万个正常细胞中的1个癌细胞，6色(或更多)流式细胞术分析是检测异常MRD免疫表型的最常用方法；(2)二代测序NGS是一种极为敏感的DNA测序方法，配合分子标签技术，其峰值灵敏度为0.0001％，即100万个正常细胞中有1个癌细胞。NGS可以检测B/T细胞抗原受体基因的克隆性重排，作为新兴的MRD检测方法，已受到国内外专家认可并推荐。2017年版国际临床实践指南(NCCN)、和2017年版《中国多发性骨髓瘤诊治指南》均推荐NGS作为MRD检测方法。NGS技术检测MRD虽然极其敏感，为保证检测结果具有良好的特异性，会要求测序深度很高，导致检测成本高、耗时长，在不同的应用领域需要加以选择；(3)第三种技术
方案是聚合酶链式反应技术，分为qPCR或RT
‑
qPCR，其灵敏度为0.1％千分之一，该技术平台具有操作简单、医院装机数量大、适用面广、成本低廉等优势，但其灵敏度和特异性不如前两种技术方案，因此，在PCR技术平台上开发灵敏度高、特异性好的技术能够更利于推广，更符合中国国情。因此，本专利技术旨在基于PCR技术寻找一种能够检测核酸样本超低频率变异的方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测核酸样本变异的寡核苷酸体系，该体系基于多重竞争机制设置，能够检测区分目标模板分子绝对数目在4个以上，目标模板在样本中大于等于三万分之一的超低频变异信息，同时基于PCR技术平台，提供了一种检测核酸样本超低频率变异的PCR技术，在微小病灶残留的检测方面具有巨大潜力。
[0006]本专利技术提供了一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系，至少包括三种寡核苷酸链：
[0007]第一寡核苷酸链上设有相连的第一序列和第二序列，第一序列与非目标模板碱基互补，与目标模板的互补序列有一个或数个碱基的差异且与第二寡核苷酸链竞争性结合目标模板；
[0008]第二寡核苷酸链与目标模板碱基互补，与非目标模板的互补序列有一个或数个碱基的差异且与第一寡核苷酸链竞争性结合非目标模板，与第三寡核苷酸链不结合、不重叠；
[0009]第三寡核苷酸链上设有相连的第三序列和第四序列，第三序列与第二序列的碱基序列相同，并竞争性结合目标模板和非目标模板，第四序列与目标模板和非目标模板的差异序列的上游序列碱基互补；
[0010]目标模板相对于非目标模板至少存在一个碱基的变异，目标模板的变异位点以及非目标模板中与变异位点对应的位点位于第一序列或第二寡核苷酸链覆盖的范围内。
[0011]本专利技术的寡核苷酸体系示意图如图1所示。寡核苷酸链FP(对应第三寡核苷酸链)自5
′
向3
′
端方向分成fp1(对应第四序列)和fp2(对应第三序列)两个部分；寡核苷酸链PB(对应第一寡核苷酸链)自5
′
向3
′
端方向分成pb2(对应第二序列)和pb1(对应第一序列)两个部分；寡核苷酸链CB(对应第二寡核苷酸链)只有cb1一个部分；tm代表目标模板，tf代表非目标模板，其上都含有com1和com2两段序列，com1代表fp2和pb2竞争结合部分，com2代表cb1和pb1竞争结合部分。本示意图以突变一个位点为例，tf和tm的区别在于mut和ref三角形标记处的信息不同，本专利技术所述的检测核酸样本变异即指检测tm上的mut区域，mut区域位于寡核苷酸链PB或寡核苷酸链CB覆盖的范围内。其中，寡核苷酸链FP、PB和CB能与样本中非目标模板tf和目标模板tm对应区域互补，寡核苷酸链FP与CB没有重叠的部分，不存在竞争。
[0012]本专利技术的寡核苷酸体系中存在多重竞争机制，为便于理解，以图1为例进行描述：(1)第一重竞争关系为fp2与pb2的竞争。fp2和pb2的碱基序列相同，且与tf和tm上的com1区域碱基互补，因此，当寡核苷酸链PB和FP同时要与非目标模板tf和目标模板tm结合时，fp2和pb2形成竞争关系，即竞争性的与com1区域结合；(2)第二重竞争关系为cb1与pb1对非目标模板tf的竞争。cb1和pb1区域内的碱基序列有重合，pb1与非目标模板tf互补，cb1序列虽然与非目标模板tf有一个或数个碱基的差异，但会与pb1区域形成竞争，通过共同竞争非目
标模板tf形成选择性差异，有助于促进cb1与目标模板tm的高特异性结合；(3)第三重竞争关系为cb1与pb1对目标模板tm的竞争。pb1和cb1区域内的碱基序列有重合，cb1与目标模板tm互补，pb1序列虽然与目标模板tm有一个或数个碱基的差本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸样本变异的寡核苷酸体系，其特征在于，所述寡核苷酸体系至少包括三种寡核苷酸链，其中：第一寡核苷酸链上设有相连的第一序列和第二序列，所述第一序列与非目标模板碱基互补，与目标模板的互补序列有一个或数个碱基的差异且与第二寡核苷酸链竞争性结合目标模板；第二寡核苷酸链与目标模板碱基互补，与非目标模板的互补序列有一个或数个碱基的差异且与第一寡核苷酸链竞争性结合非目标模板，与第三寡核苷酸链不重叠；第三寡核苷酸链上设有相连的第三序列和第四序列，所述第三序列与第二序列的碱基序列相同，并竞争性结合目标模板和非目标模板，所述第四序列与目标模板和非目标模板的差异序列的上游序列碱基互补；所述目标模板相对于所述非目标模板至少存在一个碱基的变异，目标模板的变异位点以及非目标模板中与所述变异位点对应的位点位于第一序列或第二寡核苷酸链覆盖的范围内。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸体系，其特征在于：对于目标模板，第三寡核苷酸链的吉布斯自由能小于第一寡核苷酸链的吉布斯自由能，第一序列的吉布斯自由能大于第二寡核苷酸链的吉布斯自由能；对于非目标模板，第三寡核苷酸链的吉布斯自由能大于第一寡核苷酸链的吉布斯自由能，第一序列的吉布斯自由能小于第二寡核苷酸链的吉布斯自由能。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸体系，其特征在于：在45℃、1M Na
+
浓度下，所述第一寡核苷酸链的吉布斯自由能、第二寡核苷酸链的吉布斯自由能或第三寡核苷酸链的吉布斯自由能满足
‑
57.96kcal/mol≤ΔG≤
‑
14.81kcal/mol；所述第二序列或第三序列的吉布斯自由能满足
‑
1.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊峰，董博昊，赵伟，杨宏星，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：