一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，属于分子生物学技术领域。首先构建游离DNA基因文库，经重亚硫酸盐处理后，进行PCR扩增，通过磁珠纯化，纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段，扩增后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库，使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。本发明专利技术的检测方法能够一次性获得样本多个基因目标区域甲基化突变信息，使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实。现实。

【技术实现步骤摘要】
一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒

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[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒。

技术介绍
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[0002]恶性肿瘤目前已成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，在充分有效且不良反应极低的抗肿瘤药物被开发之前，肿瘤的早期发现仍然是降低肿瘤病死率的最有效方法。早期原位肿瘤在发生转移之前，可以通过手术切除，但肿瘤一旦发生转移，则很难通过手术根治。从肿瘤细胞产生到发生转移之前的窗口期，是检测和诊断肿瘤的黄金时期。研究表明，初期转移肿瘤患者的预后效果明显优于已发生转移的晚期肿瘤患者。对于多数肿瘤患者，早期发现能够使患者得到及时的治疗，并拥有更大的治愈机会。因此，癌症的早筛具有重要的医学价值和社会价值，且肿瘤的早期发现能够极大的提高治愈率、降低死亡率、降低治疗副作用和治疗费用。近年来随着表观遗传学研究的进展，DNA甲基化已经成为目前研究最多且最清楚的表观修饰方式，在肿瘤的发生发展中，DNA甲基化异常是其重要的诱因，其在肿瘤发生的早期阶段即可发生并具有组织特异性，提示了甲基化可以作为新的肿瘤分子标志物具有独特的优势。
[0003]DNA甲基化是表观遗传中最常见的一种修饰现象，指的是甲基转移酶将一个甲基基团可逆地添加到DNA序列中胞嘧啶的第五号位置的碳原子上面，从而形成5
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甲基胞嘧啶。DNA的甲基化与许多人类复杂的疾病有关，包括癌症、肥胖和肥胖相关疾病、糖尿病、神经退行性疾病及年龄相关的常见疾病等。由于DNA甲基化而导致的基因沉默，在胚胎的早期发育、基因组印记和X染色体失活等诸多方面起着重要的作用，但是某些基因的异常甲基化也会使得基因表达调控发生紊乱，进而导致疾病的发生。所以DNA的甲基化状态与癌症密切相关，异常的甲基化能够在早期癌症中被检测到，因此，DNA的甲基化状态可以用来作为泛癌种诊断的标志物。
[0004]高通量测序(High
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Throughput Sequencing)又称为下一代测序(NextGeneration Sequencing，NGS)，通过NGS技术能够同时处理数以百万计的基因片段，相较于第一代测序方法，它的基因检测的灵敏度更高，效率更快且耗费成本更低，能够实现大规模的高通量、高深度并行测序。NGS技术的特点使其迅速运用在医学基础与临床的研究，在检测病原微生物、药物基因组、各类遗传病，尤其是在肿瘤基因学方面发挥的巨大的作用。NGS技术广泛应用于实体肿瘤中，发现了更多新的基因突变，在人类恶性肿瘤变异遗传途径的研究中发挥了重大的作用。虽然NGS测序与传统的Sanger法测序相比成本大大降低，但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。
[0005]目标序列捕获技术的出现，满足了上述需求。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序，在靶向富集过程中不感兴趣的DNA片段会被最大
限度的去除，使得测序所产生的结果主要集中于感兴趣的目标区域。目前常用的序列捕获方法有：PCR法、分子倒置探针法(MolecuLar insersion probe，MIP)和杂交捕获法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，不过这种方法并不能很容易扩大目标区域，适合捕获一些很小的区域，且部分区域扩增困难，针对突变频率较低的体细胞突变检测灵敏度不够等问题没有很好的解决办法。分子倒置探针法具有样品前期处理简单、样品需求量小等优点，然而其分子探针合成成本较高，均一性较差，难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获。杂交捕获法通过目标DNA片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获
有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述PCR法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。
[0006]重亚硫酸盐测序(Bisulfite
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Seq)是前期用重亚硫酸盐处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，然后进行PCR扩增变成T，与原本甲基化修饰的C碱基进行区分，再对PCR产物进行高通量测序的方法。该方法具有通量高、耗时少、单碱基分辨率高与高覆盖率的优点，被称为甲基化测序的金标准。避免了酶切法中因为酶切不完全而导致的假阳性问题，且敏感性较高。

技术实现思路
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[0007]为解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，本专利技术的检测方法灵敏、可靠、可用于早期癌症的筛查。
[0008]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0009]本专利技术提供一种基于目标区域捕获甲基化突变检测方法，主要包括以下步骤：
[0010](1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建游离DNA基因文库；
[0011](2)将步骤(1)得到的游离DNA基因文库经重亚硫酸盐处理后，进行PCR扩增，通过AMPure XP磁珠纯化；
[0012](3)将步骤(2)纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的高DNA甲基化片段进行甲基化捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；
[0013](4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增，然后利用AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库；
[0014](5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。
[0015]进一步地，步骤(1)中所述的游离DNA通过Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取获得。
[0016]进一步地，步骤(1)中所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A
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Tailing Enzyme Mix反应体系完成。
[0017]进一步地，步骤(2)中所述的重亚硫酸盐处理通过Qiagen EpiTect Fast Bisulfite Kit试剂盒完成。
[0018]进一步地，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交通过甲基化捕获BisCap试剂盒
完成。
[0019]进一步地，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交捕获目标区域为610个与肿瘤发生发展密切相关的基因启动子区域。
[0020]进一步地，步骤(4)中所述的扩增通过PCR反应进行。
[0021]进一步地，步骤(5)中所述的Illumina测序平台包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq。
[0022]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于目标区域捕获甲基化突变检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建游离DNA基因文库；(2)将步骤(1)得到的游离DNA基因文库经重亚硫酸盐处理后，进行PCR扩增，通过AMPure XP磁珠纯化；(3)将步骤(2)纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增，然后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库；(5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的游离DNA通过Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取获得；所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A
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Tailing Enzyme Mix反应体系完成。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的重亚硫酸盐处理通过Qiagen EpiTect Fast Bisulfite Kit试剂盒完成。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交捕获的目标区域为610个与肿瘤发生发展密切相关的基因启动子区...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏志，刘琦，赵金银，杨金，许立志，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：