基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒以及它们在液相杂交捕获中的应用。所述捕获试剂盒包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，其中，所述2×浓度溶液包含100‑150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1‑3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2‑5mg/ml的Carrier RNA及15‑20w/w％的硫酸葡聚糖，其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。

【技术实现步骤摘要】
基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及基因组测序文库杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒以及它们在液相杂交捕获中的应用。
技术介绍
20世纪初诞生了新一代测序技术(NextGenerationSequencing，NGS)，这一技术的出现为DNA测序
带来了突飞猛进的进展。与一代测序技术相比，二代测序技术具有高通量、高准确性的技术特点，可对数以亿计的DNA片段同时进行测序。与传统的Sanger法测序相比NGS测序成本大大降低。但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。目标序列捕获技术的出现，满足了上述需求。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序，在靶向富集过程中不感兴趣的DNA片段会被最大限度的去除，使得测序所产生的结果主要集中于感兴趣的目标区域。目前常用的序列捕获方法有：PCR法、分子倒置探针法(MolecuLarinsersionprobe，MIP)和杂交捕获法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，不过这种方法并不能很容易扩大目标区域，适合捕获一些很小的区域，且部分区域扩增困难，针对突变频率较低的体细胞突变检测灵敏度不够等问题没有很好的解决办法。分子倒置探针法具有样品前期处理简单、样品需求量小等优点，然而其分子探针合成成本较高，均一性较差，难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获。杂交捕获法通过目标DNA片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获
有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述PCR法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。液相杂交捕获技术中高效的捕获效率及高准确性主要取决于三个方面：1.探针的准确性及特异性；2.杂交缓冲液环境及杂交条件；3.杂交后的洗涤缓冲液环境及洗涤条件。高准确度及高特异性的生物亲和素标记探针是高杂交准确性的保证，本领域现有的探针合成技术已能够达到该水平，如IDT公司的探针合成技术。而找到一种高效的杂交缓冲液、杂交条件及洗涤缓冲液及洗涤方法显得尤为重要，这一环节是有效提高杂交效率，提高捕获准确性，简化实验流程及降低成本的主要瓶颈及限速步骤。因此，基于以上研究成果及技术特点，开发一种高效的、准确度高的、低成本的液相杂交捕获试剂及方法较为迫切，以满足对靶向测序日益增长的要求。
技术实现思路
本专利技术涉及用于双链核酸杂交及洗涤的新型组合物、相关试剂盒以及杂交洗涤方法。这些组合物和方法与传统过程相比，能够更快、更高效、捕获效果更好地完成基因组DNA的靶标区域富集。本专利技术的一个方面在于提供一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，其中，所述2×浓度溶液包含100-150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1-3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2-5mg/ml的CarrierRNA及15-20w/w％的硫酸葡聚糖，其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。优选地，所述4×柠檬酸钠溶液由20×柠檬酸钠溶液稀释5倍配制得到，所述20×柠檬酸钠溶液包含3M氯化钠、0.3M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液由50×Denhardt溶液稀释25倍配制得到，所述50×Denhardt溶液包含1％聚蔗糖400、1％聚乙烯吡咯烷酮以及1％牛血清蛋白。在一个优选的实施方式中，所述2×浓度溶液包含100mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、2mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2mg/ml的CarrierRNA及20w/w％的硫酸葡聚糖。本专利技术的又一方面提供一种上述基因组测序文库杂交捕获试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：将所述2×浓度溶液与所述100％去离子甲酰胺以及探针溶液按照以下条件混合：所述2×浓度溶液在最终溶液中被稀释一倍，并且去离子甲酰胺在最终溶液中的浓度为20-50v/v％。再一方面，本专利技术提供了一种基因组测序文库杂交捕获溶液，其通过上述使用方法获得。又一方面，本专利技术提供一种用于基因组测序文库杂交捕获后的洗涤溶液试剂盒，其包括以下5种洗涤缓冲液组分：1)Stringent洗涤溶液：2×柠檬酸钠缓冲液，30％v/v％去离子甲酰胺；2)洗涤溶液I：2×柠檬酸钠溶液，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)；3)洗涤溶液II：2×柠檬酸钠溶液；4)洗涤溶液III：0.2×柠檬酸钠溶液；以及5)链霉亲和素磁珠洗涤溶液：10mMTris-HClpH7.5-8.0，1mMEDTA以及2MNaCl，其中，所述2×柠檬酸钠溶液包含0.3M氯化钠以及0.03M柠檬酸钠，pH7.0，并且所述0.2×柠檬酸钠溶液包含0.03M氯化钠以及0.003M柠檬酸钠，pH7.0。优选地，所述2×柠檬酸钠溶液以及0.2×柠檬酸钠溶液均为20×柠檬酸钠溶液的稀释液，所述20×柠檬酸钠溶液包含3M氯化钠以及0.3M柠檬酸钠，pH7.0。本专利技术的另一方面提供一种基因组测序文库杂交试剂盒，其包含上述杂交捕获试剂盒以及上述洗涤溶液试剂盒。本专利技术的另一方面提供了上述基因组测序文库杂交试剂盒在探针对基因组DNA测序文库进行杂交捕获富集中的用途。再一方面，本专利技术提供一种液相杂交捕获方法，其中，在所述方法中使用上述杂交捕获试剂盒和/或上述洗涤溶液试剂盒。有益效果本专利技术提供的双链核酸液相杂交捕获溶液及洗涤溶液试剂盒具有较高的效率，可以缩短杂交时间至16h，而商品化试剂盒一般杂交时间为64-72h，因此，可以大大缩短试验周期，降低成本；洗涤溶液具有较好的洗脱效果，大幅减少了非目标区域DNA片段，有效提高靶向富集效率，降低成本。附图说明图1显示三个实验组中4个目标基因的富集倍数的比较结果。图2显示三个实验组中2个非目标基因的富集倍数的比较结果。其中，实验组1使用商品化试剂盒杂交溶液及洗涤溶液，实验组2和实验组3使用本专利技术捕获溶液及洗涤溶液试剂盒，实验条件相同，评价自制试剂性能。目标基因与非目标基因的富集倍数通过实时定量PCR(realtime-qPCR)进行检测。检测结果为三次独立重复试验所得平均值±标准误差(mean±SEM)。具体实施方式在本专利技术中的术语“2×浓度溶液”是指该溶液的浓度是其在使用时工作液浓度的2倍，也理解为在使用时需将该溶液稀释一倍。下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细的描述，但是本领域技术人员将会理解，在本专利技术各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节，也可以实现本申请各权利要求保护的技术方案。在本专利技术的以下示例中使用的Denhardt’soluction购自Amresco公司，CarrierRNA购自天根生化科技有限公司，去离子甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，其中，所述2×浓度溶液包含100‑150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1‑3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2‑5mg/ml的Carrier RNA及15‑20w/w％的硫酸葡聚糖，其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，其中，所述2×浓度溶液包含100-150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1-3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2-5mg/ml的CarrierRNA及15-20w/w％的硫酸葡聚糖，其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。2.根据权利要求1所述的基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其中，所述2×浓度溶液包含100mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、2mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2mg/ml的CarrierRNA及20w/w％的硫酸葡聚糖。3.一种权利要求1或2所述的基因组测序文库杂交捕获试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：将所述2×浓度溶液与所述100％去离子甲酰胺以及探针溶液按照以下条件混合：所述2×浓度溶液在最终溶液中被稀释一倍，并且去离子甲酰胺在最终溶液中的浓度为20-50v/v％。4.一种根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金银，李宏志，姜旭，刘琦，许立志，于闯，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21