用于鉴定烤烟龙江981的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定烤烟龙江981的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法，属于生物分子鉴别技术领域。本发明专利技术利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得一套适用于鉴定烤烟龙江981的特异性SNP标记共10个，其物理位置基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定，包含SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1～10所示。针对烤烟龙江981的SNP位点侧翼序列，根据检测方法的不同设计相应引物，可用于烤烟龙江981的品种鉴定。本发明专利技术基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立的烤烟龙江981品种鉴定方法，检测周期短、通量高。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定烤烟龙江981的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法
本专利技术涉及一种用于鉴定烤烟龙江981的引物组合，同时还涉及包含该引物组合的试剂盒、应用及鉴定方法，属于生物分子鉴别

技术介绍
烟草是一种重要的经济作物，是卷烟生产的主要原料。烤烟品种龙江981是由黑龙江省烟草科学研究所以龙江912作母本、CV87为父本，采用常规育种技术定向选育而成的烤烟新纯系品种。该品种植株结构合理，遗传性状稳定，田间生长势强，易烘烤。龙江981株式筒形，叶形长椭圆，叶尖渐尖，叶缘波浪状，叶面稍皱，叶色浅绿，茎叶角度中等，主脉粗细中等，花序较集中，花冠粉红色；中下部叶片田间落黄较快且集中，上部叶片落黄相对较慢，耐成熟，易烘烤，移栽至中心花开66d左右，大田生育期122d左右。龙江981是近年来我国烟叶生产中重要的主栽烤烟品种，也是卷烟生产中重要的工业常用品种。品种是优质烟叶原料生产的基础，是影响烟叶品质最主要的因素之一。根据《中华人民共和国种子法》和《烟草专卖法》，为保证烟叶生产的稳定性和可持续发展，必须选用经全国烟草品种审定委员会审(认)定的品种，严禁种植劣杂品种。此外，烟草工业生产和产品开发对特定烟叶品种也提出了严格的要求。目前，我国面临着烟草主栽品种的遗传背景狭窄，形态学上相似程度高难以区分鉴别的问题。烟草品种的检测方法主要是田间种植鉴定法。但是，该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多(鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等)、周期长(跨越烟草不同生育期)、鉴别难度大(性状指标差异小)、同一性状年度间存在差异(受环境影响)等不足。烟草品种保护，种子纯度的监测，烟叶真假检测等方面，都迫切需要从分子水平上进行烟草DNA身份鉴定。专利CN105734141A公开了一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，包括：分别提取对照与待测烟草品种的基因组总DNA，采用最新测序技术对其进行适当深度的全基因组测序，基于烟草基因组参考序列利用生物信息学手段对它们进行序列拼接、组装与全基因组序列比较，统计二者碱基差异，计算出待测烟草品种相对于对照烟草品种的纯度百分比。该方法不受环境条件和季节影响，鉴定结果准确可靠，可从最小遗传单位单碱基变异水平上准确鉴别烟草品种的纯度，用于烟草品种亲本提纯与真伪鉴定。但是该方法操作复杂，检测成本非常高。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单等优点。随着全基因组序列鉴定技术以及自动化的SNP芯片分型技术的发展，利用大规模、高通量SNP芯片进行遗传多样性研究已经变得越来越普遍。国家烟草基因研究中心设计研制出首张烟草高密度SNP芯片(420KTobaccoSNParray)，涵盖绝大多数标签SNP位点并均匀分布整个烟草基因组，为从全基因组水平上对烟草品种进行遗传多样性研究提供了便利。采用烟草高密度SNP芯片标记技术对烟草主栽品种的遗传多样性进行分析，可以筛选获得特定主栽品种的特异性SNP分子标记，并依据该特异性SNP标记设计烟草品种鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定烤烟龙江981的引物组合。其次，本专利技术还提供一种烤烟龙江981鉴定试剂盒。再次，本专利技术再提供一种上述引物组合或试剂盒在烤烟龙江981品种鉴定方面的应用。最后，本专利技术还提供一种能够简单、快速、高效地鉴定烤烟龙江981的方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：用于鉴定烤烟龙江981的引物组合，所述引物针对烤烟龙江981的10个特异性SNP位点侧翼序列设计，具体根据检测方法的不同对应设计引物。这10个SNP标记是基于近年来我国烟草主栽品种全基因组SNP分型结果筛选出来的烤烟龙江981独有的特异性SNP位点，其物理位置是基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定的，具体位点信息如下表1所示，分别命名为FP01～FP10。包含这10个SNP位点的基因序列如SEQIDNO:1～10所示。表1烤烟龙江981的10个特异性SNP位点信息所述检测方法可采用SNP经典检测法如PCR-RFLP、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异PCR(AS-PCR)法，或是采用SNPs高通量检测法如DNA测序法、基因芯片技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、Taqman探针法、SNapshot法、MassARRAY分子量阵列技术，以实现烤烟龙江981的品种鉴定。烤烟龙江981鉴定试剂盒，除包含上述引物组合外，还可以包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、PCREnzyme、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEXterminationmix、iPLEXEnzyme、水等。上述引物组合或试剂盒在烤烟龙江981品种鉴定方面的应用。具体为：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中10个SNP位点的基因型与下表2中所示的结果完全一致，则判定该烟草样本为烤烟龙江981。表2烤烟龙江981中各SNP位点的基因型本专利技术优选采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MassARRAY分子量阵列平台)，并基于AssayDesignSuit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合如下表3所示。表3基于烤烟龙江981的特异性SNP位点设计的引物组合烤烟龙江981的鉴定方法，包括以下步骤：1)SNP位点多重PCR扩增反应以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；2)SAP酶反应用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；3)单碱基延伸反应在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；4)基因型检测及结果判定对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中10个SNP位点的基因型与烤烟龙江981的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟龙江981；烤烟龙江981中10个SNP位点FP01～FP10的基因型依次为AA、GG、CC、AA、GG、TT、TT、TT、AA、AA。步骤1)中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR缓冲液0.5μL、25mMMgCl20.4μL、25mMdNTPs0.1μL、5U/μLPCREnzyme0.2μL、1μM扩增引物的混合液(等量混合)1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA1μL，水补足至5μL；反应条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45个循环；72℃5min。步骤2)中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μLSAP0.3μL和10×SAP缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃40min，85℃5min。步骤3)中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEXterminationmix0.2μL、33U/μLiPLEXEnzyme0.041μL和1μM延伸引物的混合液(等量混合)0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃30s；[94℃5s、(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定烤烟龙江981的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟龙江981的10个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含这10个SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1～10所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定烤烟龙江981的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟龙江981的10个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含这10个SNP位点的基因序列如SEQIDNO:1～10所示。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述10个特异性SNP位点的引物序列如SEQIDNO:11～40所示。3.包含如权利要求1或2所述引物组合的烤烟龙江981鉴定试剂盒。4.如权利要求1或2所述引物组合、权利要求3所述试剂盒在烤烟龙江981品种鉴定方面的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中10个SNP位点的基因型与烤烟龙江981的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟龙江981；烤烟龙江981中10个SNP位点FP01～FP10的基因型依次为AA、GG、CC、AA、GG、TT、TT、TT、AA、AA。6.采用如权利要求2所述引物组合鉴定烤烟龙江981的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)SNP位点多重PCR扩增反应以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；2)SAP酶反应用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；3)单碱基延伸反应在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；4)基因型检测及结果判定对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中10个SNP位点的基因型与烤烟龙江981的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟龙江981；烤烟龙江981...

【专利技术属性】
技术研发人员：张剑锋，何声宝，吴寿明，蔡联合，金静静，李泽锋，许亚龙，王燃，杨军，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41