本发明专利技术涉及用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定技术领域。本发明专利技术利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟毕纳1号的特异性SNP标记共15个，并对比栽培烟草参考基因组获得的15个SNP位点侧翼序列，其序列如SEQ ID NO:1～15所示，基于该序列设计引物；利用设计的引物，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对这些位点进行分型检测。根据检测结果获得SNP分型结果，鉴定样品是否为毕纳1号，本发明专利技术的检测方法检测时所需检测样品量少，检测通量高，鉴定结果准确。
【技术实现步骤摘要】
用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法
本专利技术涉及用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定
技术介绍
烟草是一种重要的经济作物，是卷烟生产的主要原料。烤烟品种毕纳1号是贵州省烟草公司毕节市公司采用系统选育方法从烤烟品种云烟85自然变异株中选育而成的烤烟新品种，于2012年10月通过全国烟草品种审定委员会贵州省烟草品种审定组审定。株型呈塔型，打顶后呈筒型，自然株高210cm左右，打顶株高150cm左右，自然叶数32左右，可采叶数24～26片，茎围9～10cm，节距4.5cm，腰叶长78.2cm，宽29.4cm，顶叶长61.5cm、宽21.7cm；叶形长椭圆形，叶色绿色，叶耳大，叶尖渐尖，花冠粉红色；田间生长整齐，生长势较强，烟叶分层落黄好，易烘烤；移栽至中心花开放72天左右，大田生育期135天左右。毕纳1号是近年来我国烟叶生产中重要的主栽烤烟品种，也是卷烟生产中重要的工业常用品种。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单等优点。随着全基因组序列鉴定技术以及自动化的SNP芯片分型技术的发展，利用大规模、高通量SNP芯片进行遗传多样性研究已经变得越来越普遍。国家烟草基因研究中心设计研制出首张烟草高密度SNP芯片(420KTobaccoSNParray)，涵盖绝大多数标签SNP位点并均匀分布整个烟草基因组，为从全基因组水平上对烟草品种进行遗传多样性研究提供了便利。采用烟草高密度SNP芯片标记技术对烟草主栽品种的遗传多样性进行分析，可以筛选获得特定主栽品种的特异性SNP分子标记。基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对SNP位点设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有极高性价比。特别适合于对有限数量的SNP位点进行大规模分型检测。品种是优质烟叶原料生产的基础，是影响烟叶品质最主要的因素之一。根据《中华人民共和国种子法》和《烟草专卖法》，为保证烟叶生产的稳定性和可持续发展，必须选用经全国烟草品种审定委员会审(认)定的品种，严禁种植劣杂品种。此外，烟草工业生产和产品开发对特定烟叶品种也提出了严格的要求。目前，我国面临着烟草主栽品种的遗传背景狭窄，形态学上相似程度高难以区分鉴别的问题。烟草品种的检测方法主要是田间种植鉴定法。但是，该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多(鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等)、周期长(跨越烟草不同生育期)、鉴别难度大(性状指标差异小)、同一性状年度间存在差异(受环境影响)等不足。烟草品种保护，种子纯度的监测，烟叶真假检测等方面，都迫切需要从分子水平上进行烟草DNA身份鉴定。专利CN105734141A公开了一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，包括：分别提取对照与待测烟草品种的基因组总DNA，采用最新测序技术对其进行适当深度的全基因组测序，基于烟草基因组参考序列利用生物信息学手段对它们进行序列拼接、组装与全基因组序列比较，统计二者碱基差异，计算出待测烟草品种相对于对照烟草品种的纯度百分比。该方法不受环境条件和季节影响，鉴定结果准确可靠，可从最小遗传单位单碱基变异水平上准确鉴别烟草品种的纯度，用于烟草品种亲本提纯与真伪鉴定。但是该方法操作复杂，检测成本非常高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合，该引物可简单、快速、高效地鉴定检测样品是否为烤烟毕纳1号。本专利技术的另一个目的是提供包含上述引物组合的鉴定试剂盒。本专利技术还提供了上述引物组合及鉴定试剂盒的应用。本专利技术还提供一种能够简单、快速、高效地鉴定烤烟毕纳1号的方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合，所述引物分别针对烤烟毕纳1号的15个特异性SNP位点侧翼序列设计，具体根据检测方法的不同对应设计引物。这15个SNP标记是基于近年来我国烟草主栽品种全基因组SNP分型结果筛选出来的烤烟毕纳1号独有的特异性SNP位点，其物理位置是基于栽培烟草品种红花大金元的全基因组序列比对确定的，具体位点信息如下表1所示，分别命名为FP01～FP15。包含这15个SNP位点的基因序列如SEQIDNO:1～15所示。表1烤烟毕纳1号的15个特异性SNP位点所述检测方法可采用SNP经典检测法如PCR-RFLP、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、等位基因特异PCR(AS-PCR)法，或是采用SNPs高通量检测法如DNA测序法、基因芯片技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、Taqman探针法、SNapshot法、MassARRAY分子量阵列技术，以实现烤烟毕纳1号的品种鉴定和育种材料检测。烤烟毕纳1号鉴定试剂盒，除包含上述引物组合外，还可以包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、PCREnzyme、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEXterminationmix、iPLEXEnzyme、水等。上述引物组合或试剂盒在烤烟毕纳1号品种鉴定方面的应用。具体为：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中15个SNP位点的基因型与下表2中所示的结果完全一致，则判定该烟草样本为烤烟毕纳1号。表2烤烟毕纳1号中各SNP位点的基因型FP01FP02FP03FP04FP05FP06FP07FP08FP09FP10FP11FP12FP13FP14FP15GGAATTGGTTCCTTAATTTTCCTTCCAATT本专利技术优选采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MassARRAY分子量阵列平台)，并基于AssayDesignSuit(Agena)针对每个位点设计两条扩增引物和一条延伸引物，引物组合如下表3所示。表3基于烤烟毕纳1号的特异性SNP位点设计的引物组合烤烟毕纳1号的鉴定方法，包括以下步骤：1)SNP位点多重PCR扩增反应以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；2)SAP酶反应用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；3)单碱基延伸反应在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；4)基因型检测及结果判定对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中SNP标记FP01～FP15的基因型依次为GG、AA、TT、GG、TT、CC、TT、AA、TT、TT、CC、TT、CC、AA、TT，则判断该烟草样本为烤烟毕纳1号。步骤1)中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR缓冲液0.5μL、25mMMgCl20.4μL、25mMdNTPs0.1μL、5U/μLPCREnzyme0.2μL、1μM扩增引物的混合液1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA1μL，水补足至5μL；反应条件为：95℃2min；95℃30s、56℃30s本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟毕纳1号的15个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含15个SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1～15所示。
【技术特征摘要】
1.用于鉴定烤烟毕纳1号的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟毕纳1号的15个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含15个SNP位点的基因序列如SEQIDNO:1～15所示。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述15个特异性SNP位点的引物序列如SEQIDNO:16～60所示。3.包含如权利要求1或2所述引物组合的烤烟毕纳1号鉴定试剂盒。4.如权利要求1或2所述引物组合、权利要求3所述试剂盒在烤烟毕纳1号品种鉴定方面的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中15个SNP位点的基因型与烤烟毕纳1号的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟毕纳1号；烤烟毕纳1号中15个SNP位点FP01～FP15的基因型依次GG、AA、TT、GG、TT、CC、TT、AA、TT、TT、CC、TT、CC、AA、TT。6.采用如权利要求2所述引物组合鉴定烤烟毕纳1号的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)SNP位点多重PCR扩增反应以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；2)SAP酶反应用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；3)单碱基延伸反应在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；4)基因型检测及结果判定对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中SNP标记FP01～FP15的基因型依次为GG、AA、TT、GG、TT、CC...
【专利技术属性】
技术研发人员：张剑锋，金静静，吴寿明，何声宝，金鑫，罗朝鹏，谢小东，王中，杨军，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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