一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种cfDNA甲基化突变的检测方法及试剂盒，属于癌症早期筛查技术领域。首先构建cfDNA基因文库和filler DNA片段，混合后获得cfDNA基因文库与filler DNA混合物，加入5

【技术实现步骤摘要】
一种游离DNA(cfDNA)甲基化突变的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于癌症早期筛查
，尤其涉及一种新型cfDNA甲基化突变的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤，俗称癌症。由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而失去正常调控，过度增殖而引起的疾病。癌细胞可发生发展于体内大多数器官和组织中，可侵犯周围组织，甚至可经体内循环/淋巴系统转移到身体其他部分。据统计，癌症是全球第二大死亡原因，2018年约有1800万新发病例以及960万死亡病例。到2030年，预计全年将有2600万新发病例以及1700万死亡病例，对人类生命健康具有严重威胁。晚期癌症通常缺乏有效的治疗方法，但癌症若在早期发现，生存率将显著提高，五年生存约为91％，尽可能的在最早阶段发现肿瘤是治疗关键。近年来，在癌症早期诊断研究中，cfDNA已成为一种有前景的肿瘤生物标志物，具有巨大的早期诊断潜力。
[0003]癌症的发生、发展和转移机制的研究基于不同的平台，涉及基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和表观基因组。最近，表观基因组在正常细胞和癌细胞中的作用得到了证实，并取得了快速进展，表观基因组主要由DNA甲基化和染色质配置调控，通过改变核小体结构及其定位来调节基因表达。在正常人类细胞中，核小体保持开放构象，启动子区域没有DNA甲基化位点，而在肿瘤中核小体间距相对封闭。研究表明，DNA甲基化突变已被定义为癌症发生发展的关键事件。DNA甲基化发生于CpG位点，通过DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用，在胞嘧啶碱基的5
’r/>碳位置添加一个甲基形成5
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甲基胞嘧啶。DNA甲基化模式在癌症中频发，包括反转录因子、着丝粒和癌基因的DNA低甲基化事件等。5mC改变具有区分癌细胞和正常细胞的能力，其表观遗传谱可作为多种肿瘤标志物，用于早期诊断检测、预后监测，成为基因检测研究热点。
[0004]传统的DNA甲基化检测普遍采用重亚硫酸盐处理后进行高通量测序法，该方法由于cfDNA数量有限，并且重亚硫酸盐可导致约84％的DNA降解损失，CpGs全基因组丰度低，信息回收率有限，导致其检测灵敏度受限，结果可靠度低，检测所需成本高。

技术实现思路

[0005]为解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于免疫沉淀的cfDNA甲基化突变的检测方法以及检测试剂盒，本专利技术的检测方法灵敏、可靠、无重亚硫酸盐处理即可进行早期癌症筛查。
[0006]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0007]本专利技术提供一种cfDNA甲基化突变的检测方法，主要包括以下步骤：
[0008](1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建cfDNA基因文库；
[0009](2)将步骤(1)构建的cfDNA基因文库与提前构建好的filler DNA混合，获得cfDNA
基因文库与filler DNA混合物，保证起始投入量达到100ng以上；
[0010](3)将5
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甲基胞嘧啶抗体(5
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mC抗体)与步骤(2)得到的cfDNA基因文库与filler DNA混合物进行免疫共沉淀反应，对混合物中的高DNA甲基化片段进行甲基化捕获，然后经纯化、洗脱得到捕获后产物片段；
[0011](4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增富集，然后利用AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化回收并筛选，得到最终上机文库；
[0012](5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得cfDNA甲基化突变情况。
[0013]进一步地，步骤(1)中所述的游离DNA通过Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取获得。
[0014]进一步地，步骤(1)中所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A
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Tailing Enzyme Mix反应体系完成。
[0015]进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA未添加测序接头，目的仅为扩大cfDNA测序投入起始量。
[0016]进一步地，步骤(2)中所述的Filler DNA为6个不同大小、不同CpG密度(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG和20SCpG)的PCR扩增子组成，5个不同CpG含量的片段(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG片段)被甲基化，1个片段(20SCpG片段)未被甲基化。
[0017]进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA以λDNA为模板进行PCR反应，纯化回收，对所得的PCR片段进行甲基化，纯化回收后获得。
[0018]进一步地，步骤(2)中所述的filler DNA由50％(wt/wt)甲基化片段(1CpG,5CpG,10CpG,15CpG和20CpGL片段)和50％(wt/wt)未甲基化片段(20CpGS PCR扩增)组成。
[0019]进一步地，步骤(3)中所述的甲基化捕获通过Diagenode MagMeDIP kit及Diagenode iPure kit V2试剂盒完成。
[0020]进一步地，步骤(4)中所述的扩增富集通过LM
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PCR进行。
[0021]进一步地，步骤(5)中所述的Illumina测序平台包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq。
[0022]本专利技术一方面提供一种用于上述的cfDNA甲基化突变的检测方法的试剂盒，所述的试剂盒包括以下成分：高通量测序文库构建组分、filler DNA片段、免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分和文库富集组分。
[0023]进一步地，所述的高通量测序文库构建组分主要包括高通量文库构建中常用的末端修复、加“A”及连接接头所需要的酶及illumina测序平台专用测序接头。
[0024]进一步地，所述的filler DNA片段为6个不同大小、不同CpG密度(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG和20SCpG)的PCR扩增子组成，5个不同CpG含量的片段(1CpG、5CpG、10CpG、15CpG、20LCpG片段)被甲基化，1个片段(20SCpG片段)未被甲基化。
[0025]进一步地，所述的filler DNA片段以λDNA为模板进行PCR反应，纯化回收，对所得的PCR片段进行甲基化，纯化回收后获得。
[0026]进一步地，所述的PCR反应所需的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
12所示。
[0027]进一步地，所述的免疫共沉淀反应、甲基化捕获及纯化回收组分主要包括免疫沉淀反应所需的缓冲液试剂、抗体蛋白和甲基化捕获用的磁珠以及用于纯化回收所需要的试
剂和洗脱b本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种cfDNA甲基化突变的检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)提取全血游离DNA，经过末端修复、末端加“A”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建cfDNA基因文库；(2)将步骤(1)构建的cfDNA基因文库与提前构建好的filler DNA混合，获得cfDNA基因文库与filler DNA混合物；(3)将5
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甲基胞嘧啶抗体与步骤(2)得到的cfDNA基因文库与filler DNA混合物进行免疫共沉淀反应，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增富集，然后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收并筛选，得到最终上机文库；(5)使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得cfDNA甲基化突变情况。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的游离DNA通过QICirculating Nucleic Acid Kit试剂盒提取获得；所述的末端修复、末端加“A”通过End Repair&A
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Tailing Enzyme Mix反应体系完成。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的Filler DNA为6个不同大小、不同CpG密度的PCR扩增子组成，5个不同CpG密度的片段被甲基化，1个片段未被甲基化，甲基化片段和未甲基化片段的质量比为1:1。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的甲基化捕获通过Diagenode MagMeDIP kit及Diagenode iP...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏志，刘琦，赵金银，段心语，许立志，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：