【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法和试剂盒。
技术介绍
1、增加检测少量循环肿瘤细胞(ctcs)或微量循环无细胞肿瘤dna(ctdna)的灵敏度可以对各种恶性肿瘤患者进行mrd的检测。mrd的检测因其在血浆中的含量很低对检测方法的特异性和灵敏度的要求较高；各种检测技术参差不齐，存在技术门槛较高，检验周期长的问题。目前高通量测序技术(ngs)是肿瘤基因检测方面的主流，但ngs常用的普通意义的双端测序的建库方法对于短片段的核酸，未知序列核酸和浓度较低的液体样本的接头连接效率低，模板利用率低，漏检率较高。
2、多重pcr是一种用于同时扩增多个不同dna片段的pcr技术。它是在常规pcr基础上进行改进的一种技术，它包括引物设计，反应体系构建和反应条件设计等流程。为了保证多重pcr的准确性，所设计的引物都不能互相结合，也不能与模板dna上的目标片段以外的区域结合；另外，设计引物还需要注意以下几点：引物特异性、引物长度、退火温度等。多重pcr的反应体系与常规pcr基本相同，包括模板dna、引物、dntp和热稳定dna聚合酶等。但是，多重pcr的反应体系需要更高的浓度引物和dntp，以支持多个扩增片段的扩增。与常规pcr相似，多重pcr的反应条件包括变性、复性、延伸和退火等步骤。但是，多重pcr需要更高的退火温度和更长的延伸时间，以支持多个扩增片段的扩增。随着pcr技术的发展，出现了一些根据一小段序列信息快速扩增已知序列相邻片段的技术,其中之一就是锚定pcr(anch
技术实现思路
1、针对高通量测序技术常用的双端测序的建库方法对于短片段的核酸，未知序列核酸和浓度较低的液体样本的接头连接效率低，模板利用率低，漏检率较高等技术问题，本专利技术的目的是提供一种用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法和试剂盒，本专利技术使用单端锚定多重pcr的建库方法可以提高接头的连接效率，提高灵敏度和增加检测的特异性。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供一种用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)提取血液ctdna样本，通过末端修复、末端加a，连接短y接头后纯化；
5、(2)根据所选的目标基因区域设计相应的特异性捕获引物，对步骤(1)得到的产物进行单端锚定多重pcr捕获；
6、(3)将步骤(2)得到的产物进行第二轮pcr扩增富集，即得用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重pcr扩增子文库。
7、进一步地，步骤(1)中所述的末端修复、末端加“a”通过end repair&a-tailingenzyme mix反应体系完成。
8、进一步地，步骤(1)中所述的短y接头包括具有部分互补的上游引物f和下游引物r，所述的上游引物f包含短y接头互补序列，核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的下游引物r包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短y接头互补序列，核苷酸序列为其中所述分子标签为8～16bp的长度，由a、t、c、g任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基。
9、进一步地，步骤(2)中所述的目标基因区域包括肺癌强相关的突变区域。
10、进一步地，步骤(2)中所述的特异性捕获引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如seq id no.4-93所示；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。
11、进一步地，步骤(3)中所述pcr扩增富集过程使用富集引物进行，富集引物包括上游富集引物和下游富集引物；上游富集引物包括p5端接头序列、indexd序列和通用序列2；下游富集引物包括p7端接头序列、indexn序列和通用序列1。
12、进一步地，上述接头序列可以为任意常用的接头序列或者为新开发的接头序列，接头序列可随测序平台的不同而不同，只要满足能够进行目标测序平台的测序即可。另外，接头序列还包括长度为8bp的index序列，作用在于区分不同的dna样本，对于index序列的碱基组成没有特殊限制，可以保证将不同的dna样品区分开来即可，即：用于构建同一个dna样品的扩增子文库的引物组中，上游通用引物中的index序列不同。可选地，上述接头序列包含p5和p7接头的部分序列。
13、进一步地，步骤(3)中所述的上游富集引物的核苷酸序列如seq id no.94-102所示，所述的下游富集引物的核苷酸序列如seq id no.103-114所示。
14、本专利技术另一方面提供一种适用于血液筛查基因低频突变的检测方法，将上述构建方法获得的单端锚定多重pcr扩增子文库通过illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析和比对，获得目标区域内突变位点和突变频率。
15、进一步地，所述的illumina测序平台包括illmina nextseq 500、illuminahiseq2000、illumina hiseq2500和illumina novaseq；测序策略为pe150。
16、本专利技术另一方面提供一种用于单端锚定多重pcr扩增子文库构建的试剂盒，试剂盒包括以下成分：ctdna提取的试剂，末端修复、加“a”及连接短y接头所需要的酶、缓冲液，单端锚定多重pcr捕获的引物及试剂和扩增富集的引物及试剂。
17、进一步地，所述的短y接头包括具有部分互补的上游引物f和下游引物r，所述的上游引物f包含短y接头互补序列，核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的下游引物r包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短y接头互补序列，核苷酸序列为其中所述分子标签为8～16bp的长度，由a、t、c、g任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基。
18、进一步地，所述的特异性捕获引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如seq id no.4-93所示；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。
19、进一步地，所述扩增富集的引物包括上游富集引物和下游富集引物；上游富集引物包括p5端接头序列、indexd序列和通用序列2；下游富集引物包括p7端接头序列、indexn序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重PCR扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的短Y接头包括具有部分互补的上游引物F和下游引物R，所述的上游引物F包含短Y接头互补序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的下游引物R包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短Y接头互补序列，核苷酸序列为(5’-3’)TTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCTNN…NNTCCGACTTTATCCAT，其中所述分子标签为8～16bp的长度，由A、T、C、G任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标基因区域包括肺癌强相关的突变区域；所述的特异性捕获引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-93所示；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的上游富集引物的核苷酸序列如SEQ ID No.94-102所示，所述的下游富集引物的核苷酸序列如SEQ ID No.103-114所示。
6.一种适用于血液筛查基因低频突变的检测方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述的构建方法获得的单端锚定多重PCR扩增子文库通过Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析和比对，获得目标区域内突变位点和突变频率。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的Illumina测序平台包括Illmina NextSeq 500、Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Novaseq；测序策略为PE150。
8.一种用于权利要求1-5任一项所述的单端锚定多重PCR扩增子文库构建的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括以下成分：ctDNA提取的试剂，末端修复、加“A”及连接短Y接头所需要的酶、缓冲液，单端锚定多重PCR捕获的引物及试剂和扩增富集的引物及试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的短Y接头包括具有部分互补的上游引物F和下游引物R，所述的上游引物F包含短Y接头互补序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的下游引物R包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短Y接头互补序列，核苷酸序列为(5’-3’)TTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATCTNN…NNTCCGACTTTATCCAT，其中所述分子标签为8～16bp的长度，由A、T、C、G任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基；
10.权利要求8或9所述的试剂盒在检测肿瘤低频突变中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤低频突变的单端锚定多重pcr扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的短y接头包括具有部分互补的上游引物f和下游引物r，所述的上游引物f包含短y接头互补序列，核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的下游引物r包含通用序列1、分子标签(加粗加下划线的碱基)和短y接头互补序列，核苷酸序列为(5’-3’)ttcagacgtgtgctcttccg atctnn…nntccgactttatccat，其中所述分子标签为8～16bp的长度，由a、t、c、g任意排列组合而成，但是不出现连续四个相同碱基。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标基因区域包括肺癌强相关的突变区域；所述的特异性捕获引物包括上游捕获引物和下游捕获引物；上游捕获引物包括上游通用序列2和上游特异性引物，核苷酸序列如seq id no.4-93所示；下游捕获引物为通用引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述pcr扩增富集过程使用富集引物进行，富集引物包括上游富集引物和下游富集引物；上游富集引物包括p5端接头序列、indexd序列和通用序列2；下游富集引物包括p7端接头序列、indexn序列和通用序列1。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的上游富集引物的核苷酸序列如seq id no.94-102所示，所述的下游富集引物的核苷酸序列如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李宏志，刘悦，许立志，明鸿博，李丽珍，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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