METTL3在AML化疗耐药性中的应用制造技术

本发明专利技术具体涉及METTL3在AML化疗耐药性中的应用，属于分子生物学和医学技术领域。AML临床治疗效果不佳，预后情况较差，并且复发和难治病例无法通过常规疗法缓解。本发明专利技术通过分析AML化疗相对敏感患者与AML化疗耐药患者骨髓中METTL3表达差异，提供了一种用于检测急性髓系白血病化学药物治疗敏感度的分子标记；通过AML化疗敏感细胞株及化疗耐药细胞株及动物模型，证实了METTL3抑制剂的AML化疗耐药治疗效果。本发明专利技术研究还证实了，METTL3可通过调控AML细胞归巢介导AML化疗耐药。细胞归巢介导AML化疗耐药。细胞归巢介导AML化疗耐药。

【技术实现步骤摘要】
METTL3在AML化疗耐药性中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和医学
，涉及METTL3在急性髓系白血病(AML)化疗耐药性中的应用，具体涉及一种用于鉴定AML化疗敏感度的分子标记、试剂盒及其检测方法以及METTL3抑制剂在制备抗AML化疗耐药药物中的应用。

技术介绍

[0002]该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是目前最为常见的一类急性白血病，化疗依然是其临床治疗的主要手段。目前，仅20
‑
30％的AML患者化疗药物治疗后可达长期无病生存(Disease
‑
free survival，DFS)，而AML难治复发的主要原因是化疗耐药。因此，探究AML化疗耐药的发生机制是当前AML临床及基础研究中亟需解决的热点问题。
[0004]针对AML化疗耐药的发生机制，围绕不同的信号通路和关键调控分子，主要形成了以下学说：肿瘤ABC转运蛋白学说、凋亡失调控学说、关键基因突变学说和骨髓微环境学说等。骨髓微环境，又称骨髓龛，此学说认为一方面AML细胞上的细胞因子、生长因子和趋化因子等受体可与骨髓龛内的成骨细胞、窦状内皮细胞和基质细胞等分泌的多种可溶性因子结合，激活不同信号传导通路，促进细胞存活、增殖和抑制细胞凋亡，介导AML化疗耐药；另一方面，AML细胞可通过一系列粘附分子及细胞外基质成分与骨内膜或基质的成骨细胞紧密结合，介导AML细胞通过“Adhesion”、“Engraftment”和“Expansion”等过程归巢并藏匿于骨髓微环境中，躲避化学药物攻击的同时促进AML细胞的自我更新及生存，产生化疗耐药。但目前AML化疗耐药仍有待于进一步研究。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术的现状，专利技术人前期利用CRISPR
‑
Cas9文库筛选技术、反向蛋白微阵列技术及转录组高通量测序技术联合生物信息学分析手段筛选，经深入而广泛的研究验证，首次发现METTL3基因与急性髓系白血病化疗耐药密切相关，可作为急性髓系白血病患者临床分子生物学化学药物疗效评估的分子标记；并且专利技术人利用后续体外细胞实验及动物体内实验首次证实，METTL3可作为AML化疗耐药治疗的靶点，同时，专利技术人通过二代测序手段及AML动物模型发现并证实METTL3可以调控AML细胞的归巢。因此，METTL3及其介导的AML细胞归巢可能是AML化疗耐药的关键机制之一。
[0006]基于上述发现，本专利技术提供以下技术方案。
[0007]本专利技术第一个方面，提供检测METTL3表达水平的试剂在制备评估急性髓系白血病患者化疗效果或预后的产品中的用途。
[0008]本专利技术第二个方面，提供了一种评估急性髓系白血病化疗效果及预后的产品，所述产品包括试剂盒，所述试剂包括可以检测METTL3表达水平的PCR反应试剂。
[0009]本专利技术第三个方面，提供一种非诊断目的是否存在METTL3基因及其定量检测方
法，步骤如下：
[0010]①
采用扩增METTL3的引物扩增待检样品，得到扩增产物；
[0011]②
对扩增产物进行测序测定，检测扩增产物中是否存在METTL3；
[0012]③
与内参基因GAPDH相比，利用2
‑△
Ct
方法，计算METTL3的表达量。
[0013]本专利技术第四方面，提供METTL3作为AML化疗耐药治疗靶点在制备AML化疗耐药性产品中的应用。
[0014]本专利技术第五方面，提供METTL3在制备抑制AML细胞粘附及归巢的治疗产品中的应用。
[0015]本专利技术第六方面，提供METTL3抑制剂在制备抗AML化疗耐药活性成分的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下有益效果:
[0017]本专利技术首次发现METTL3基因表达量与急性髓系白血病化学药物治疗耐药密切相关。本专利技术评估急性髓系白血病化学药物治疗反应及预后的试剂盒检测简单、快速、准确、特异性强，对于提高诊断精确度，实现急性髓系白血病的个体化精准诊疗，增加治愈或延长急性髓系白血病患者生存期有着重要意义。
[0018]本专利技术进一步明确了METTL3在AML化疗耐药中的作用方式，依据本专利技术研究成果，抑制METTL3的功能可以通过抑制AML细胞归巢，抑制AML细胞化疗耐药。本专利技术研究结果进一步明确了METTL3介导AML化疗耐药的作用机制，有利于AML化疗耐药临床治疗药物的开发，具有十分重要的临床意义。
附图说明
[0019]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0020]图1为METTL3基因表达量与白血病患者临床化学药物治疗反应及预后的相关性，CR：急性髓系白血病患者2周期化疗后达完全缓解的初诊骨髓样本；
[0021]Refractory/Relapsed：急性髓系白血病患者2周期化疗后未达到完全缓解的初诊骨髓样本及复发的急性髓系白血病患者骨髓样本。
[0022]图2为AML化疗耐药细胞株THP
‑
1/IDA、Kasumi
‑
1/IDA、K562/A02及HL
‑
60/ADR分别与其对应AML敏感株中METTL3表达的差异。
[0023]图3为实施例3中所述METTL3过表达后人源化AML小鼠药敏模型生存期的变化。
[0024]图4为METTL3过表达前后THP
‑
1细胞内通路的变化及粘附相关通路的变化。
[0025]图5为实施例4中所述THP
‑
1及Kasumi
‑
1细胞内METTL3过表达后ITGA4的表达变化。
[0026]图6为实施例4中所述THP
‑
1及Kasumi
‑
1细胞内METTL3过表达后AML细胞迁移及粘附至HUVEC细胞的变化。
[0027]图7为实施例4中所述METTL3过表达后，归巢及定植至NSG小鼠骨髓及脾脏中的AML细胞比例变化。
[0028]图8为实施例5中所述METTL3抑制剂处理后AML化疗耐药细胞及其对应敏感细胞膜表面ITGA4的表达变化。
[0029]图9为实施例5中所述METTL3抑制剂处理后AML化疗耐细胞及其对应敏感细胞的粘附及归巢能力变化。
[0030]图10为实施例5中所述METTL3抑制剂处理后AML化疗耐细胞及其对应敏感细胞的化疗耐药能力变化。
具体实施方式
[0031]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测METTL3表达水平的试剂在制备评估急性髓系白血病患者化疗效果或预后的产品中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述METTL3在难治或化疗后复发急性髓系白血病患者中表达上调。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括RT
‑
PCR、qRT
‑
PCR或高通量测序平台检测用试剂。4.一种评估急性髓系白血病化疗效果及预后的产品，所述产品包括试剂盒，所述试剂包括可以检测METTL3表达水平的PCR反应试剂。5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述PCR反应试剂包括扩增METTL3的引物；优选的，所述引物序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示；进一步的，PCR反应试剂还包括dNTP、DEPC水和SYBR Green；进一步的，扩增METTL3的PCR条件为:95℃1min；95℃15s，62℃15s，72℃45s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃持续。6.一种非诊断目的是否存...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪春岩，叶静静，孙涛，李明颖，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：