一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQ ID NO:1所示的探针1以及SEQ ID NO:2所示的引物1F和SEQ ID NO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQ ID NO:4所示的探针2以及SEQ ID NO:5所示的引物2F和SEQ ID NO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30 SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示。通过本发明专利技术的试剂盒及检测方法，可精确检测CAR在CAR T细胞中的表达情况，并根据检测结果选择CAR表达量最高的CAR T细胞回输至人体内。

【技术实现步骤摘要】
一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒
本专利技术涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒以及检测方法。
技术介绍
CD30是霍奇金淋巴瘤和一些非霍奇金淋巴瘤的恶性细胞常常表达的细胞表面抗原，因此，在治疗这类疾病时，最好能够使用可靶向CD30的药物或疫苗。细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的有核细胞中，诱导其表达CAR并且分化成T细胞后，将其回输至人体。表达CAR的T细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。在这种治疗方法中，CAR的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将T细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动T细胞的杀伤活性。此外，在将CAR表达载体导入T细胞中后，需要高效和准确的方法来检测所得到的CART细胞中CAR是否被有效表达。荧光定量PCR是一种精确检测目的基因表达情况的技术。根据化学原理的不同，荧光定量PCR可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强。Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90-110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。由于Taqman探针的苛刻要求，导致探针和扩增引物的位置都不容易选取。此外，还需考虑到在CAR表达载体构建过程中或表达载体在CART细胞内的复制过程中发生突变的情况，如果突变位置正好出现在探针或扩增引物的范围内，则有可能因为错配而影响检测结果。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，所述CART细胞中转染了带有编码CD30SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQIDNO:7所示，所述荧光定量试剂盒包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQIDNO:1所示的探针1以及SEQIDNO:2所示的引物1F和SEQIDNO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQIDNO:4所示的探针2以及SEQIDNO:5所示的引物2F和SEQIDNO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针，所述CART细胞中转染了带有编码CD30SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQIDNO:7所示。优选地，所述探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-FAM，3’端均带有淬灭基团6-TAMRA。优选地，所述荧光定量试剂盒还包括标准品、阳性对照样品和阴性对照样品，其中所述标准品为包含定量所述表达载体质粒的样品，所述阳性对照样品为含有SEQIDNO:7所示序列的DNA样品，所述阴性对照样品为不含SEQIDNO:7所示序列的DNA样品。本专利技术还提供了一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的方法，其包括以下步骤：S1：从CART细胞提取RNA并反转录成cDNA；S2：将所述cDNA分别与所述第一引物探针组和第二引物探针组加上荧光定量PCR试剂构成第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系；S3：进行荧光定量PCR反应，并通过所述荧光定量PCR反应的数据确定CART细胞中的CAR表达量。优选地，在S2前进行步骤S4：使用梯度稀释的所述标准品制作标准曲线。优选地，在S2中还分别使用所述阳性对照和阴性对照样品配制了阳性对照PCR体系和阴性对照PCR体系，并且所述阳性对照PCR体系和阴性对照PCR体系在S3中与所述第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系在同一荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。通过本专利技术的试剂盒及检测方法，可精确检测CAR在CART细胞中的表达情况，并根据检测结果选择CAR表达量最高的CART细胞回输至人体内，以达到最佳的抗肿瘤治疗效果。附图说明图1为实施例中编码CD30嵌合抗原受体的DNA片段的示意图；图2为荧光定量标准曲线；图3为经检测得到的样品1-4的模板拷贝数；图4为样品1-4的CART细胞对CD30阳性细胞的杀伤活性；图5为样品1-4的CART细胞对不表达CD30的细胞的杀伤活性；。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒的构建通过人工合成SEQIDNO:7所示的长度为1623bp的DNA片段，其中，第1-819位的核苷酸编码CD30SCFV，第820-954位的核苷酸编码CD8铰链区，第955-1158位的核苷酸编码CD28，第1159-1284位的核苷酸编码41BB，第1285-1623位的核苷酸编码CD3(图1)。后面三个区域构成胞内信号区。将上述DNA片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro的CMV启动子下游，得到CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒。2.CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞1)慢病毒的包装制备将CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒和辅助质粒psPAX2、pMD2.G以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(Invitroge)转染，具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃2000g离心10min，转移上清至新EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。2)T细胞的制备取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(Mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清(Invitrogen)的AIM-V培养基(Invitrogen)诱导培养48h，得到T细胞。3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养从-80℃取出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×106个上述诱导培养的T细胞。将细胞悬液加入24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％CO2培养箱内培养8h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4ml培养上清，加入1.4ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2、50ng/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示，其特征在于，包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQ ID NO:1所示的探针1以及SEQ ID NO:2所示的引物1F和SEQ ID NO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQ ID NO:4所示的探针2以及SEQ ID NO:5所示的引物2F和SEQ ID NO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，所述CART细胞中转染了带有编码CD30SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQIDNO:7所示，其特征在于，包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQIDNO:1所示的探针1以及SEQIDNO:2所示的引物1F和SEQIDNO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQIDNO:4所示的探针2以及SEQIDNO:5所示的引物2F和SEQIDNO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针。2.根据权利要求1所述的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-FAM，3’端均带有淬灭基团6-TAMRA。3.根据权利要求1或2所述的荧光定量试剂盒，其特征在于，还包括标准品、阳性对照样品和阴性对照样品，其中所述标准品为包含定量所述表达载体质粒的样品，所述阳性对照样品为含有SEQIDNO:7所示序列的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，顾潮江，胡广，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42