一种靶向CA9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种靶向CA9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用，属于基因工程技术领域。一种靶向表达CA9表面抗原细胞且分泌IL

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CA9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种靶向CA9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达CAR后，将其回输至人体。表达CAR的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。然而，CAR T细胞在治疗实体瘤的过程中却屡屡碰壁，现在仍然面临诸多问题及挑战，新型的CAR结构，新的靶点的发掘是CAR
‑
T治疗实体瘤的关键。
[0003]CA9(Carbonic anhydrase 9)是一种跨膜蛋白，是已知仅有的两种与肿瘤相关的碳酸酐酶同工酶之一。在以往的研究中发现，除了在正常组织中表达外，CA9在肺鳞癌，肺腺癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸润癌，宫颈鳞癌和腺癌，胆管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，胰腺癌，直肠癌，肉瘤，胸腺癌，胃癌，子宫内膜样癌等多种癌症中，CA9表达升高。在众多的肿瘤免疫相关分子中，CA9可以作为实体瘤免疫治疗的一个理想靶标，因此，在治疗上述肿瘤疾病时，最好能够使用可靶向CA9的药物或疫苗。
[0004]IL
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15SA融合蛋白可以延长IL15在血清中的半衰期并增加IL15β受体对免疫细胞的亲和力，募集CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞，能够特异性结合IL
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15并与周围效应NK细胞和T细胞上的IL
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15R β
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γ链形成免疫突触结构，激活NK/T细胞的JAK/STAT等通路发挥作用(Cheever MA，et al.2008；Mortier E，et al.2006)。促进CD3+T细胞(主要是CD8+T细胞)和NK1.1+NK细胞增殖；增强体内细胞因子对IgG或T细胞参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的影响(Waldmann TA，et al.2020；Akdis M，et al.2011)；IL
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15还可以促进寿命更长、亲和力更高的CD8+T细胞的诱导，可以非常有效地杀死肿瘤细胞，最终增强免疫疗法的抗肿瘤作用(Xu H，et al.2021；Qiyue Hu，et al.2018；Martin A，et al.2008)。
[0005]IL1RL2/IL
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36R受体结合并通过其发出信号的细胞因子，进而激活靶细胞中的NF
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kappa
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B和MAPK信号通路。IL
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36信号系统的一部分，被认为存在于上皮屏障中并参与局部炎症反应；类似于与其共享辅助受体IL1RAP的IL
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1系统。通过作用于角质形成细胞、树突状细胞和间接作用于T细胞来驱动组织浸润、细胞成熟和细胞增殖，从而参与皮肤炎症反应(Bachmann M，et al.2012)。在培养的角质形成细胞中诱导巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞趋化因子的表达，例如CCL3、CCL4、CCL5、CCL2、CCL17、CCL22、CL20、CCL5、CCL2、CCL17、CCL22、CXCL8、CCL20和CXCL1；还刺激其自身的表达以及原型皮肤促炎参数TNF
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α、S100A7/牛皮癣和诱导型NOS的表达(Gresnigt M.S，et al.2013)。可能在特定中性粒细胞气道炎症期间的促炎反应中发挥作用：激活原发性肺成纤维细胞中的丝裂原活化蛋白激酶和NF
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kappa B，并刺激肺成纤维细胞中IL
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8和CXCL3和Th17趋化因子CCL20的表达。可能参与对真菌病原体(如烟曲霉)的先天免疫反应(Debets R，et al.2001；Foster A.M，et al.2014)。
将IL
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36
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γ基因工程入CAR，可以显著的改善增殖和持久性。表达IL
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36γ的CAR
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T细胞能够增强肿瘤小鼠脾巨噬细胞和树突状细胞上MHC II类和CD86的表达，提示IL
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36在抗原提呈细胞的成熟中发挥作用。在小鼠模型，显示出超强的抗肿瘤活性(Li X，etal.2020)。
[0006]CXCL11(C
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X
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C motif chemokine ligand 11，C
‑
X
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C基序趋化因子11又名干扰素诱导的T细胞α趋化因子(I
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TAC))，是CXC趋化因子家族中的小分子量细胞因子(Huoman J，et al.2021)。它在外周血白细胞、胰腺和肝脏中高度表达，在胸腺、脾和肺中中等程度表达，在小肠、胎盘和前列腺组织中低度表达(Moreno B，et al.2022)。CXCL11通过与细胞表面趋化因子受体CXCR3相互作用来作用于靶细胞。CXCL11可以趋化活化的T细胞(Rot A，et al.2010；LiL，et al.2022)。
[0007]CCR8(C
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C motif chemokine receptor 8)是趋化因子受体亚家族的成员之一，属于G蛋白偶联受体。人CCL1是CCR8的主要配体，其它配体有CCL8、CCL16和CCL18。CCR8在肿瘤浸润的调节性T细胞(Treg)上特异性表达，在Th2细胞和肿瘤细胞也均有表达；然而在外周血Treg或正常组织上基本不表达。CCR8的主要作用是参与Tregs和Th2细胞向炎症和肿瘤部位的募集。大量研究发现，高表达的CCR8与多种癌症相关，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、转移性脑癌、转移性肝癌，尤其是在乳腺癌分离的Tregs细胞上(Karin，，et al.2018；Das，Suvendu，et al..2013)。
[0008]CCLI结合CD4+T细胞上的CCR8，导致CD4+T细胞转化为Tregs，再募集Tregs；CCL1结合Tregs上的CCR8，Tregs向炎症或肿瘤部位募集。CCR8
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CCL1轴不仅将CCR8+Tregs招募到TME中。CCR8
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CCL1还可诱导对Tregs抑制至关重要的FO
×
P3和CD39，以及IL
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10的上调，这将增强Treg的免疫抑制活性。研究发现，与正常组织中的Tregs相比，CCR8在人类乳腺癌的肿瘤浸润性Tregs中显著上调，表明CCR8是TME中Tregs上的一个有希望的治疗靶点，而不会引起系统性自身免疫(Whiteside，Sarah K.，et al.2021；Roose，Heleen，et al.2021；Korbecki，Jan，et al.2020)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向表达CA9表面抗原细胞且分泌IL
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15SA融合蛋白或IL
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36γ，CXCL11并在膜上表达CCR8或CXCR6的融合嵌合抗原受体，其特征在于，包含CD8α信号肽、靶向CA9的scFv、StrepII标签蛋白，CD8α铰链域，CD28跨膜结构域和CD28细胞内信号结构域，41
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BB共刺激域，CD3ζ信号传导域，分泌IL
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15SA、IL
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36γ或CXCL11融合蛋白的结构域，膜表达CCR8或CXCR6的结构域。2.根据权利要求1所述融合嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CA9的scFv的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24；其对应的核苷酸序列包括SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：48。3.根据权利要求1所述融合嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示，Strep II标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示，CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示，CD28跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示，CD28细胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，4
‑
1BB共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示，CD3ζ信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO：61所示。4.根据权利要求1所述融合嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示，Strep II标签蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示，CD8α铰链域的核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示，CD28跨膜域的核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示，CD28细胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示，4
‑
1BB共刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示，CD3ζ信号传导域的核苷酸序列如SEQ ID NO：62所示。5.根据权利要求1所述融合嵌合抗原受体，其特征在于，所述分泌IL
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15SA融合蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，孙钒，吕梦清，崔烨挺，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：