一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于小分子环肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种基于Pep42改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地靶向细胞膜表面葡萄糖调控蛋白78(cell surface glucose

【技术实现步骤摘要】
一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用


[0001]本专利技术属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。

技术介绍

[0002]生物免疫治疗是一种新兴的，具有显著疗效的肿瘤治疗方法，是继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗手段，它在不破坏机体免疫系统功能的前提下，通过特异性识别肿瘤细胞，进而消灭组织中的肿瘤细胞而实现治疗肿瘤的目的。免疫细胞疗法是生物免疫治疗中的一种重要类型，其中，又以过继免疫细胞治疗发展最为迅猛。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor
‑
Tcell,CAR
‑
T)疗法是一种常见的过继免疫细胞疗法，该方法直接将可识别肿瘤抗原的基因片段(包括纳米抗体、单链抗体、细胞因子和配体等)与T细胞活化所需信号分子(包括CD3ζ链、CD28和4
‑
1BB等共刺激分子)基因结合，构建成嵌合抗原受体(CAR)，通过基因转导的方式导入并修饰T细胞，赋予T细胞识别肿瘤抗原并迅速活化杀伤肿瘤细胞的能力，能有效规避MHC的限制性。目前，CAR
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T疗法在血液恶性肿瘤治疗方面取得了巨大成功，实体瘤治疗方面，存在CAR
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T归巢难，肿瘤微环境抵抗和缺少肿瘤特异性或相关性抗原等问题，亟待解决。
[0003]内质网应激是细胞应对内质网蛋白积累产生的一种应答形式，可诱发未折叠蛋白反应(UPR)，即细胞通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加内质网分子伴侣表达等方式缓解内质网压力，内质网应激持续时间过长或过强，超过细胞自身未折叠蛋白反应的调节能力，将会引起细胞代谢紊乱和凋亡等。肿瘤微环境中，由于缺氧、葡萄糖饥饿和酸中毒等不利因素的存在常引起内质网应激反应，肿瘤细胞通过激活未折叠蛋白反应来适应这些不利条件，避免死亡。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)又称Bip蛋白，由HSPA5基因编码，是内质网未折叠蛋白反应的关键分子。在内质网应激下，GRP78可大量表达并促进蛋白质正确折叠，缓解内质网压力，具有极强的抗细胞凋亡能力。大量文献证明，GRP78在肺癌、肝癌、结直肠癌等多种实体瘤细胞中表达上调，并部分转移到细胞膜表面参与PI3K/AKT和JAK2/STAT3等信号通路的激活调控。GRP78细胞膜转移的特性在正常细胞中很少见，提示csGRP78可作为CAT
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T治疗实体瘤的抗原，理论上具有很好的特异性和安全性。
[0004]因此，靶向csGRP78构建有效工作的CAR
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T对实体瘤或其它csGRP78表达异常相关性疾病的治疗具有重要价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种以基于环肽PEP42构建的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备和应用方法。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地结合Pep42受体，并且所述的胞外结合域
具有环肽结构。
[0007]在另一优选例中，所述的环肽结构是基于小分子环肽Pep42的环肽结构，并且特异性地结合Pep42受体。
[0008]在另一优选例中，所述的CAR的胞外结合域除了含有针对Pep42受体的具有环肽结构的第一胞外结构域之外，还包括针对额外靶点的第二胞外结构域。
[0009]在另一优选例中，所述的额外靶点为肿瘤特异性靶点。
[0010]在另一优选例中，所述的环肽结构位于胞外结合域的末端(即N端)或中间。
[0011]在另一优选例中，所述环肽结构的长度为12
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15个氨基酸；较佳地13
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15个氨基酸。
[0012]在另一优选例中，所述的环肽结构(或Pep42肽段)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或其氨基酸序列与SEQ ID NO:1的相同性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥93％，或与SEQ ID NO:1相比具有1、2或3个氨基酸的差异。
[0013]在另一优选例中，所述的Pep42受体选自下组：细胞膜表面Grp78(csGrp78)。
[0014]在另一优选例中，其特征在于，所述的胞外结合域包括Pep42肽段，所述的Pep42肽段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0015]在另一优选例中，所述的胞外结合域具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0016]在另一优选例中，所述的Pep42肽段与葡萄糖调节蛋白78(GRP78)受体具有特异性结合。
[0017]在另一优选例中，所述的GRP78是位于细胞膜表面(或膜结合)的GRP78蛋白(csGRP78)。
[0018]在另一优选例中，所述的GRP78蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0019]在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)；优选为灵长动物。
[0020]在另一优选例中，所述的GRP78蛋白是人源的或猴源的。
[0021]在另一优选例中，所述的GRP78蛋白是人源的。
[0022]在另一优选例中，所述的Pep42具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0023]在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：
[0024]L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀ
(I)
[0025]式中，
[0026]各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
[0027]L是无或信号肽序列；
[0028]EB是胞外结合域；
[0029]H是无或铰链区；
[0030]TM是跨膜结构域；
[0031]C是无或共刺激信号分子；
[0032]CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
[0033]RP是无或报告蛋白。
[0034]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点，优选地为T2A序列。
[0035]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为荧光蛋白。
[0036]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白。
[0037]在另一优选例中，所述的mKate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0038]在另一优选例中，所述的L是选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM
‑
CSF、CD4、CD137、或其组合。
[0039]在另一优选例中，所述的L是CD8来源的信号肽。
[0040]在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0041]在另一优选例中，所述的H是选自下组的蛋白的铰链区：CD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地结合Pep42受体，并且所述的胞外结合域具有环肽结构。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的胞外结合域包括Pep42肽段，所述的Pep42肽段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR的结构如下式I所示：L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀꢀ
(I)式中，各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；L是无或信号肽序列；EB是胞外结合域；H是无或铰链区；TM是跨膜结构域；C是无或共刺激信号分子；CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；RP是无或报告蛋白。4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体。5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭东，袁云仓，余威，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：