【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成表达系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年9月5日提交的美国临时申请第63/075,134号的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体在此并入。
[0003]序列表
[0004]根据37CFR 1.52(e)(5)，本说明书参考了序列表(以命名为“G091970067WO00
‑
SEQ”的.txt文件电子提交)。所述.txt文件是于2021年8月26日生成的并且大小为401,042字节。序列表通过引用以其整体在此并入。
[0005]本公开涉及包括转录单元的合成表达系统、包括合成表达系统的宿主细胞以及用于甲醇非依赖性生物产生蛋白质和其它期望分子的方法。
技术介绍
[0006]在生物产物(例如，蛋白质、核酸、小分子等)的产生中已使用了某些甲基营养型酵母细胞，这部分是由于甲基营养型酵母细胞的天然启动子系统的强大且可调节的特性。例如，在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中已成功产生了许多重组蛋白质，所述巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母，其中重组蛋白质产生通常是由其内源性甲醇调节的AOX1启动子，P(AOX1)驱动的。尽管基于P(AOX1)的产生系统得到良好表征、优化、强大且在工业史上有广泛用途，但P(AOX1)的甲醇依赖性限制了巴斯德毕赤酵母表达系统对限制性过程条件的使用。这在大规模产生环境中是特别严重的问题，因为甲醇在大规模下是高度毒性且易燃的化合物，危险且不期望。
技术实现思路
[0007]需要一种匹配或超过现...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种甲基营养型宿主细胞，其包括合成表达系统，所述合成表达系统包括：(a)第一转录单元，所述第一转录单元包括：(i)输入启动子，所述输入启动子包括上游激活序列(UAS)和核心启动子元件，以及(ii)编码合成转录因子的至少一种组分的多核苷酸，其中所述合成转录因子包括DNA结合结构域(DBD)和转录激活结构域(TAD)，其中所述DBD和所述TAD对于所述甲基营养型宿主细胞来说不是天然的，其中所述输入启动子驱动所述合成转录因子的所述至少一种组分的表达；以及(b)第二转录单元，所述第二转录单元包括与所关注基因可操作地连接的合成输出启动子，其中所述合成转录因子为所述合成输出启动子的激活子，并且其中所述所关注基因是在不存在外源提供的甲醇的情况下表达的。2.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元的所述多核苷酸编码所述合成转录因子的所有组分。3.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子是合成的。4.根据权利要求3所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子与天然存在的启动子具有至少90％序列同一性。5.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子是天然存在的。6.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子对所述细胞来说是天然的。7.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子为可调节的输入启动子。8.根据权利要求7所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子为诱导型的。9.根据权利要求7所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子为阻遏型的。10.根据权利要求7所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子响应于同源培养过程中的营养物添加、限制或耗竭。11.根据权利要求10所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子响应于硫胺素耗竭、甘油限制、单糖限制或响应于碳源、糖、淀粉、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、肌醇、甘油、维生素、类固醇、氮源、硝酸盐、亚硝酸盐、铵、氨基酸、甲硫氨酸、重金属、铜、苯甲酸、过氧化氢、含钙化合物和/或磷酸盐的限制。12.根据权利要求10所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子响应于任何两种或更多种营养物的组合的限制或耗竭。13.根据权利要求10所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子的活性由于存在外源提供的甲酸而提高。14.根据权利要求7所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述可调节的输入启动子能在不存在外源提供的甲醇的情况下调节。15.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子不是甲醇诱导型的。16.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子为组成型输入启
动子。17.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子的所述上游激活序列(UAS)和/或所述核心启动子元件对于所述甲基营养型宿主细胞来说不是天然的。18.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子为P(JEN1)、P(GQ6704499)、P(GQ6700926)、P(HGT1)、P(FDH1)、P(AOX2)、P(RGI2)、P(THI13)_短、P(THI13)_长或P(THI4)。19.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子为与SEQ ID NO:16
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25中的任一项的核酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的多核苷酸。20.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述输入启动子为具有SEQ ID NO:16
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25中的任一项的核酸序列的多核苷酸。21.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子的所述DNA结合结构域(DBD)为Bm3R1、TetR、PhlF_AM或VanR_AM。22.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子的所述转录激活结构域(TAD)为B112_TAD、B42_TAD、GAL4_TAD、miniVPR_TAD、Mxr1_TAD、PH_TAD、VP16_TAD、VP64_TAD、VP64v2_TAD、VPH_TAD或VPR_TAD。23.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子的所述DNA结合结构域(DBD)为Bm3R1、TetR、PhlF_AM或VanR_AM，并且所述合成转录因子的所述转录激活结构域(TAD)为B112_TAD、B42_TAD、GAL4_TAD、miniVPR_TAD、Mxr1_TAD、PH_TAD、VP16_TAD、VP64_TAD、VP64v2_TAD、VPH_TAD或VPR_TAD。24.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子不是所述输入启动子的激活子。25.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子为单组分合成转录因子。26.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子为双组分或多组分合成转录因子。27.根据权利要求26所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述双组分或多组分合成转录因子包括至少两种生物缀合蛋白质产物。28.根据权利要求27所述的甲基营养型宿主细胞，其中第一生物缀合蛋白质产物(BPP1)为SpyTag002，并且第二生物缀合蛋白质产物(BPP2)为SpyCatcher002。29.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括核定位信号(NLS)。30.根据权利要求29所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述核定位信号为SV40核定位信号。31.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括接头。32.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括自切割多肽。33.根据权利要求32所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述自切割多肽为2A肽。34.根据权利要求32所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述自切割多肽为ERBV_1_P2A。35.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括寡聚化结
构域。36.根据权利要求35所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述寡聚化结构域为仅_用于_寡聚化_的接头、三聚化_结构域或七聚化_结构域。37.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括具有SEQ ID NO:41
‑
55中的任一项的氨基酸序列的多肽。38.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元包括具有SEQ ID NO:26
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40或182
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185中的任一项的核酸序列的多核苷酸。39.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子不是甲醇诱导型的。40.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子包括上游激活序列(UAS)和核心启动子元件。41.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)对于所述甲基营养型宿主细胞来说不是天然的。42.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述核心启动子元件具有长度不超过300个碱基对的核酸序列。43.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述核心启动子元件具有长度为约6个碱基对至约300个碱基对、约25个碱基对至约250个碱基对、约75个至约225个碱基对或约100个碱基对至约175个碱基对的核酸序列。44.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)的3'端与所述核心启动子元件的5'端之间的距离的长度为0个至约200个碱基对。45.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)与所述核心启动子元件之间的距离为具有长度为约6个碱基对至约200个碱基对、约6个碱基对至约53个碱基对、约20个碱基对至约150个碱基对、约50个碱基对至约125个碱基对或约50个碱基对至约100个碱基对的核酸序列。46.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述核心启动子元件包括与天然存在的核心启动子序列至少90％、至少95％或100％相同的核心启动子序列。47.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述核心启动子元件包括与来自P(AOX1)、P(DAS2)、P(HHF2)或P(PMP20)的核心启动子序列至少90％、至少95％或100％相同的核心启动子序列。48.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)为bmO、tetO、phlO或vanO。49.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子进一步包括一个或多个操作子。50.根据权利要求49所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子的所述一个或多个操作子对所述甲基营养型宿主细胞来说不是天然的。51.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括所述DNA结合结构域(DBD)Bm3R1，并且所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)包括bmO的一
个或多个拷贝。52.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括所述DNA结合结构域(DBD)PhlF_AM，并且所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)包括phlO的一个或多个拷贝。53.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括所述DNA结合结构域(DBD)TetR，并且所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)包括tetO的一个或多个拷贝。54.根据权利要求40所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成转录因子包括所述DNA结合结构域(DBD)VanR_AM，并且所述合成输出启动子的所述上游激活序列(UAS)包括vanO的一个或多个拷贝。55.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述合成输出启动子包括具有SEQ ID NO:56
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70或186
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193中的任一项的核酸序列的多核苷酸。56.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述所关注基因表达为RNA。57.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述所关注基因编码蛋白质。58.根据权利要求57所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述所关注基因编码酶、结构蛋白、信号传导蛋白、调节蛋白、运输蛋白、传感蛋白、马达蛋白、防御蛋白或储存蛋白。59.根据权利要求57所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述蛋白质对分子进行合成、修饰或转化。60.根据权利要求59所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述分子为血红素或血红素生物合成通路中的中间体。61.根据权利要求57所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述蛋白质为血红素结合蛋白。62.根据权利要求61所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述血红素结合蛋白为血红蛋白、神经球蛋白、细胞球蛋白、豆血红蛋白或肌红蛋白。63.根据权利要求57所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述蛋白质为牛痘病毒加帽酶、T7聚合酶或O
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甲基转移酶。64.根据权利要求57所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述蛋白质为血红素生物合成通路的酶。65.根据权利要求64所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述血红素生物合成通路的酶为细胞色素P450、9
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腺苷酸环化酶、可溶性鸟苷酸环化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和/或细胞色素氧化酶。66.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其进一步包括在所述第二转录单元中的编码分泌标签的多核苷酸。67.根据权利要求66所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述分泌标签为α
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淀粉酶分泌标签、Sc Mfα1分泌标签或前菊粉酶分泌标签。68.根据权利要求66所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述所关注基因编码蛋白质，并且其中所述蛋白质从所述甲基营养型宿主细胞中分泌。69.根据权利要求68所述的甲基营养型宿主细胞，其中所分泌的蛋白质为α
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淀粉酶、β
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乳球蛋白或卵清蛋白。70.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和/或所述第
二转录单元进一步包括转录终止子。71.根据权利要求70所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和/或所述第二转录单元的所述转录终止子是天然存在的。72.根据权利要求70所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和/或所述第二转录单元的所述转录终止子是合成的。73.根据权利要求70所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和/或所述第二转录单元的所述转录终止子来自编码核糖体蛋白的基因。74.根据权利要求73所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述基因编码核糖体蛋白S2(RPS2)。75.根据权利要求73所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述转录终止子包括具有SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147的核酸序列的多核苷酸。76.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和所述第二转录单元被间隔子分开。77.根据权利要求1所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元和/或所述第二转录单元以多个拷贝存在。78.根据权利要求77所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元与所述第二转录单元的拷贝数比率为1:1。79.根据权利要求77所述的甲基营养型宿主细胞，其中所述第一转录单元与所述第二转录单元的拷贝数比率为至...
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