罗汉果甙的生物合成制造技术

本申请中描述了酶(例如葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)、UDP‑糖基转移酶(UGT)、C11羟化酶、环氧化物酶(EPH)、角鲨烯环氧酶、和/或细胞色素P450还原酶)、表达酶的宿主细胞、以及使用这样的宿主细胞产生罗汉果醇前体、罗汉果醇、和/或罗汉果甙的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】罗汉果甙的生物合成相关申请的交叉引用本申请要求于2018年11月09日提交的标题为“罗汉果甙的生物合成”的美国临时申请序列号62/758,474(其公开内容通过引用被整体并入本文)在35U.S.C§119(e)下的优先权权益。对于经由EFS-WEB以TEXT文件提交的序列表的引用本申请含有已经由EFS-WEB以ASCII格式提交并且特此通过引用整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2019年11月09日，命名为G091970023WO00-SEQ-OMJ.TXT，且大小为928千字节。专利
本公开涉及在重组细胞中产生罗汉果醇前体、罗汉果醇和罗汉果甙。背景罗汉果甙是葫芦烷衍生物的配糖体。罗汉果甙作为甜味剂和糖替代品备受追捧，是在植物(包含罗汉果(Siraitiagrosvenorii(S.grosvenorii))的果实中天然地合成的。尽管罗汉果甙已经被认为具有抗癌、抗氧化和抗炎特性，但对确切参与罗汉果甙生物合成的酶的表征是有限的。此外，从果实中提取罗汉果甙是一项劳动密集型的工作，并且罗汉果甙的结构复杂性往往阻碍了从头化学合成。概述专利技术的方面涉及包括编码UDP-糖基转移酶(UGT)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述UGT包括下列区：对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的区，其中所述区包括相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的氨基酸置换；和/或对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基179至198的区，其中所述区包括相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基179至198的氨基酸置换；其中相对于包括编码野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的异源多核苷酸的对照宿主细胞，宿主细胞在存在至少一种罗汉果甙前体的情况下多产生至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或者100％的一种或更多种罗汉果甙。在一些实施方案中，相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)，UGT展现出活性(例如，比活性)至少1.3倍的增加。在一些实施方案中，UGT包括位于结构基序中的氨基酸残基处的氨基酸置换，结构基序对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)中的选自下列的结构基序：环(loop)6、α螺旋3、环11、α螺旋6、环12和α螺旋7。在一些实施方案中，UGT能够催化下列转变：罗汉果醇至MIA1的转变；罗汉果醇至MIE1的转变；MIA1至MIIA1的转变；MIE1至MIIE的转变；MIIA1至MIIIA1的转变；MIA1至MIIE的转变；MIIA1至MIII的转变；MIIIA1至赛门苷I的转变；MIIE至MIII的转变；MIII至赛门苷I的转变；MIIE至MIIIE的转变；和/或MIIIE至赛门苷I的转变。在一些实施方案中，UGT能够：在C24处糖基化罗汉果醇；在C3处糖基化罗汉果甙；在C3处支化糖基化(branchingglycosylation)罗汉果甙；或者支化糖基化罗汉果甙C24。在一些实施方案中，UGT包括氨基酸残基处的氨基酸置换，氨基酸残基对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)中的选自下列的氨基酸残基：H83；T84；T85；N86；P89；L92；Y179；S180；A181；G184；A185；V186；T187；K189；H191；K192；G194；E195；和A198。在一些实施方案中,宿主细胞还包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸。专利技术的另外的方面涉及包括编码UGT的异源多核苷酸的宿主细胞，其中UGT包括下列区：对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的区，其中该区包括相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的氨基酸置换；和/或对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基179至198的区，其中该区包括相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基179至198的氨基酸置换；其中UGT包括与SEQIDNO:109小于90％的一致性。在一些实施方案中，相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)，UGT展现出活性(例如，比活性)至少1.3倍的增加。在一些实施方案中，UGT包括位于结构基序中的氨基酸残基处的氨基酸置换，结构基序对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)中选自下列的结构基序：环6、α螺旋3、环11、α螺旋6、环12、和α螺旋7。在一些实施方案中，UGT能够催化：罗汉果醇至MIA1的转变；罗汉果醇至MIE1的转变；MIA1至MIIA1的转变；MIE1至MIIE的转变；MIIA1至MIIIA1的转变；MIA1至MIIE的转变；MIIA1至MIII的转变；MIIIA1至赛门苷I的转变；MIIE至MIII的转变；MIII至赛门苷I的转变；MIIE至MIIIE的转变；和/或MIIIE至赛门苷I的转变。在一些实施方案中，UGT能够：在C24处糖基化罗汉果醇；在C3处糖基化罗汉果甙；在C3处支化糖基化罗汉果甙；或者支化糖基化罗汉果甙C24。在一些实施方案中，宿主细胞还包括编码CDS酶的异源多核苷酸。专利技术的另外的方面涉及包括编码UGT的异源多核苷酸的宿主细胞，其中UGT包括对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的N143或L374的残基处的氨基酸置换，其中相对于包括编码野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的异源多核苷酸的宿主细胞，所述宿主细胞在存在至少一种罗汉果甙前体的情况下多产生至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或者100％的一种或更多种罗汉果甙。在一些实施方案中，相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)，UGT展现出活性(例如，比活性)至少1.3倍的增加。在一些实施方案中，UGT包括位于UGT的结构基序中的氨基酸残基处的氨基酸置换，结构基序对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)中的选自下列的结构基序：环6、α螺旋3、环11、α螺旋6、环12、和α螺旋7。在一些实施方案中，UGT能够催化下列转变：罗汉果醇至MIA1的转变；罗汉果醇至MIE1的转变；MIA1至MIIA1的转变；MIE1至MIIE的转变；MIIA1至MIIIA1的转变；MIA1至MIIE的转变；MIIA1至MIII的转变；MIIIA1至赛门苷I的转变；MIIE至MIII的转变；MIII至赛门苷I的转变；MIIE至MIIIE的转变；和/或MIIIE至赛门苷I的转变。在一些实施方案中，UGT能够：在C24处糖基化罗汉果醇；在C3处糖基化罗汉果甙；在C3处支化糖基化罗汉果甙；或者支化糖基化罗汉果甙C24。在一些实施方案中，宿主细胞还包括编码CDS酶的异源多核苷酸。专利技术的另本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述CDS包括：/na)基序GX

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181109 US 62/758,4741.一种包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述CDS包括：
a)基序GX1WASDLGGP(SEQIDNO:331)，其中X1是N或者H；
b)基序DX1GWL(SEQIDNO:332)，其中X1是H或者Q；和/或
c)基序CWGVCFTYAGW(SEQIDNO:333)，
其中所述CDS不包括罗汉果CDS的序列(SEQIDNO:73)；并且
其中相对于对照，所述宿主细胞多产生至少10％、20％、或30％的葫芦烷二烯醇化合物，其中所述对照是表达由对应于SEQIDNO:33的多核苷酸编码的罗汉果CDS的宿主细胞。


2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中
a)基序GX1WASDLGGP(SEQIDNO:331)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基117-126的残基处；
b)基序DX1GWL(SEQIDNO:332)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基479-483的残基处；和/或
c)基序CWGVCFTYAGW(SEQIDNO:333)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基612-622的残基处。


3.一种包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述CDS包括：
a)基序GHWASDLGGP(SEQIDNO:334)；和/或
b)基序DQGWL(SEQIDNO:335)。


4.如权利要求3所述的宿主细胞，其中：
a)基序GHWASDLGGP(SEQIDNO:334)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基117-126的残基处；和/或
b)基序DQGWL(SEQIDNO:335)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基479-483的残基处。


5.一种包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述CDS包括：
a)基序GHWANDLGGP(SEQIDNO:336)；
b)基序DQGWL(SEQIDNO:335)；和/或
c)基序CWGVCYTYAGW(SEQIDNO:337)。


6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中：
a)基序GHWANDLGGP(SEQIDNO:336)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基117-126的残基处；
b)基序DQGWL(SEQIDNO:335)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基479-483的残基处；和/或
c)基序CWGVCYTYAGW(SEQIDNO:337)位于所述CDS中的对应于SEQIDNO:73中的残基612-622的残基处。


7.如权利要求1-6中任一项所述的宿主细胞，其中所述异源多核苷酸与SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、或者SEQIDNO:12至少90％一致。


8.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述CDS与SEQIDNO:43、SEQIDNO:49、或者SEQIDNO:52至少90％一致。


9.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述异源多核苷酸与SEQIDNO:3至少90％一致。


10.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述CDS与SEQIDNO:43至少90％一致。


11.一种包括编码葫芦烷二烯醇合成酶(CDS)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述异源多核苷酸序列与SEQIDNO:3至少90％一致和/或由所述异源多核苷酸编码的所述CDS的氨基酸序列与SEQIDNO:43至少90％一致，并且其中所述宿主细胞产生葫芦烷二烯醇化合物。


12.如权利要求1-11中任一项所述的宿主细胞，其中所述葫芦烷二烯醇化合物是24-25环氧-葫芦烷二烯醇或者葫芦烷二烯醇。


13.如权利要求1-12中任一项所述的宿主细胞，其中所述CDS包括氨基酸残基处的亮氨酸，所述氨基酸残基对应于SEQIDNO:743的位点123处的氨基酸残基。


14.如权利要求1-13中任一项所述的宿主细胞，其中所述CDS酶包括底物通道和活性位点空穴。


15.如权利要求1-14中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包括一种或更多种编码UDP-糖基转移酶(UGT)、C11羟化酶、细胞色素P450还原酶、环氧化物酶(EPH)、和/或角鲨烯环氧酶的异源多核苷酸。


16.一种产生葫芦烷二烯醇化合物的方法，所述方法包括：
使权利要求1-15中任一项所述的宿主细胞与氧化角鲨烯接触，从而产生所述葫芦烷二烯醇化合物。


17.如权利要求16所述的方法，其中所述葫芦烷二烯醇化合物是24-25环氧-葫芦烷二烯醇或者葫芦烷二烯醇。


18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述氧化角鲨烯是2-3-氧化角鲨烯或者2,3；22,23-二环氧角鲨烯。


19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分离所述葫芦烷二烯醇化合物。


20.如权利要求1-15中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞、植物细胞、或者细菌细胞。


21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。


22.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。


23.一种包括编码UDP-糖基转移酶(UGT)的异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述UGT包括：
(a)对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的区，其中所述区包括相对于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基83至92的氨基酸置换；和/或
(b)对应于野生型UGT94-289-1(SEQIDNO:109)的残基179至198的区，其中所述区包括相对于野生型U...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·C·安德森，J·I·布切尔，N·弗洛雷斯，J·延森，S·马尔，M·麦克曼，D·萨兰，J·王，J·朱，
申请(专利权)人：银杏生物制品公司，
类型：发明
国别省市：美国;US