一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高活力和高转化率蔗糖异构酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。该突变体包括突变体Y246L、H287R、H481P，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体的基因，并在大肠杆菌表达系统中进行表达，得到的蔗糖异构酶突变体活力和转化率显著提高。本发明专利技术制备的蔗糖异构酶突变体是一种更高效的生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中应用可以提高生产效率，减少生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体及应用
本专利技术涉及一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体及应用，属于基因工程

技术介绍
异麦芽酮糖(isomaltulose)又称帕拉金糖，分子式为C12H22O11，是一种功能性二糖，属蔗糖同分异构体，为还原性糖，可被加氢还原。异麦芽酮糖晶体呈正交晶体，含水时异麦芽酮糖晶体的相对分子质量变为360.32，熔点为120-128℃，25℃时水溶性为250g/L；与蔗糖相比甜度自然且甜度为其52％，因而可作为新型甜味剂替代蔗糖。美国FDA批准异麦芽酮糖作为安全型食品添加剂，无摄入量限制。其所具有的理化性质和生理功能也使得异麦芽酮糖能够替代蔗糖广泛的应用于功能饮料，减肥保健品，糖尿病人食品中等。我国糖尿病患者，肥胖综合症患者数以千万计，因而成为异麦芽酮糖工业化生产的市场保证。目前，全球已有40多个国家和地区已开始使用异麦芽酮糖来替代蔗糖作为食品添加剂，其中欧美与日本使用最多，2009年消耗量就已经达到100000t。而就我国而言，异麦芽酮糖需求量大，而国内异麦芽酮糖的工业化生产起步晚产能低，因而所需产品主要依赖德国和日本的进口，其中该糖的市场售价为1.5万元/t。异麦芽酮糖在自然界极少，只少量的存在于蜂蜜和甘蔗汁中，因而直接的提取方法不可用。目前，经文献报道的异麦芽酮糖合成方法主要有：化学合成法、植物体内转化法、微生物细胞转化法、蔗糖异构酶转化法。化学合成法成本高且污染大，植物体内转化法会导致植物生产停滞，而微生物细胞转化法由于发酵液成分复杂，导致后期分离纯化困难。故目前生产异麦芽酮糖的最佳方式为蔗糖异构酶转化法。蔗糖异构酶，又称α-葡糖基转移酶，能够将蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量单糖的一种酶。蔗糖异构酶的催化机理：亲核攻击作用蔗糖使α1-β1糖苷键断裂及果糖基的取向；异构化或水解的发生。蔗糖异构化过程即蔗糖异构酶催化蔗糖转化的两种去向如图4所示。用蔗糖异构酶来实现异麦芽酮糖的高产率，高纯度，低成本的生产始终是蔗糖异构酶研究的方向。在用蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖的过程中，酶的利用率低和不可避免生成的副产物是两个重要的不利因素，且因为这两个因素使得异麦芽酮糖的生产成本维持在较高水平，而高成本也限制了异麦芽酮糖替代蔗糖的步伐。与单糖副产物的产生相比，在使用蔗糖异构酶的过程中，产生蔗糖的另一种同分异构体——海藻酮糖，由于其和异麦芽酮糖结构的相似性，使得下游分离纯化的难度提高，一般工业上分离海藻酮糖与异麦芽酮糖使用重结晶的方法。更高的异麦芽酮糖转化率意味着在生产过程中，可以使异麦芽酮糖的产率更高，或生产纯度更高的异麦芽酮糖产品。与此同时，提高蔗糖异构酶的酶活，可以提高生产效率，减少生产成本。为了获得更高效的生物催化剂，筛选新的并且可能具有高效率生成异麦芽酮糖的蔗糖异构酶是当前的关键任务。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体、工程菌及应用，通过定点突变的办法，对筛选到的蔗糖异构酶进行分子改造，从而进一步提高其催化活性并得到更适合于工业应用的蔗糖异构酶。技术方案：本专利技术采用的技术方案如下。本专利技术的第一个目的是，提供一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体，该蔗糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8其中任意一种所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述蔗糖异构酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蔗糖异构酶经以下任意一种定位突变方式获得：Ⅰ.第387位氨基酸由酪氨酸突变成亮氨酸，得突变体Y246L；Ⅱ.第287位氨基酸由组氨酸突变成精氨酸，得突变体H287R；Ⅲ.第481位氨基酸由组氨酸突变成精氨酸，得突变体H481P。本专利技术的另一个目的是，提供一种编码蔗糖异构酶突变体的基因，该基因的核苷酸序列包括以下任意一种：a)SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7其中任意一种所示的碱基序列；b)编码由如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8其中任意一种所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，该基因的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示的模板核苷酸序列通过PCR扩增得到，所述PCR扩增对应的正向引物分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13所示，对应的反向引物分别如SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14所示。本专利技术的另一个目的是，提供一种用于编码蔗糖异构酶突变体的重组表达质粒，含有权利要求3所述的核苷酸序列，表达载体包括pET-28a(+)。本专利技术的另一个目的是，提供一种高效表达蔗糖异构酶的工程菌株，所述工程菌株能代谢产生上述的蔗糖异构酶突变体，或整合有上述的蔗糖异构酶突变体的基因，或含有上述的重组表达质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述工程菌株以包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌在内的宿主微生物为感受态细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。本专利技术的另一个目的是，提供一种蔗糖异构酶突变体粗酶液，挑选上述的工程菌株中的阳性单克隆菌株进行发酵培养，经分离、纯化得蔗糖异构酶突变体发酵液，再经过滤后得所述蔗糖异构酶突变体粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养的条件为：发酵温度37℃、发酵时间16-18h；所述纯化的方法为镍离子亲和层析。本专利技术的另一个目的是，提供上述的高效表达蔗糖异构酶的工程菌株或上述的蔗糖异构酶突变体粗酶液的应用，具体包括作为生物催化剂，用于催化异麦芽酮糖合成。在本专利技术的一种实施方式中，在所述催化异麦芽酮糖合成的反应体系中，底物浓度为400g/L，加酶量25U/g，pH为4-7，温度为30-55℃。在本专利技术的一种实施方式中，在所述催化异麦芽酮糖合成的反应体系中，pH为5.5，温度为40℃。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术通过设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体的基因，并在大肠杆菌表达系统中进行表达，得到的蔗糖异构酶突变体活力和转化率显著提高；(2)本专利技术制备的蔗糖异构酶突变体是一种更高效的生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中应用可以提高生产效率，减少生产成本，在制备异麦芽酮糖过程中，底物的转化率有效提高至89.5％，相较于野生株，提高了15％以上。(3)本专利技术制备的蔗糖异构酶突变体作为生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中，底物浓度提高至400g/L，适用于工业化大规模生产，具有广阔的实际生产应用前景。附图说明图1为蔗糖异构酶突变体Y246L反应产物的鉴定结果图；图2为温度对蔗糖异构酶与其突变体Y246L、H287R、H481P催化反应的影响；图3为pH对蔗糖异构酶与其突变体Y246L、H287R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8其中任意一种所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8其中任意一种所示。


2.根据权利要求1所述的具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述蔗糖异构酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蔗糖异构酶经以下任意一种定位突变方式获得：
Ⅰ.第387位氨基酸由酪氨酸突变成亮氨酸，得突变体Y246L；
Ⅱ.第287位氨基酸由组氨酸突变成精氨酸，得突变体H287R；
Ⅲ.第481位氨基酸由组氨酸突变成精氨酸，得突变体H481P。


3.一种编码蔗糖异构酶突变体的基因，其特征在于，核苷酸序列包括以下任意一种：
a)SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7其中任意一种所示的碱基序列；
b)编码由如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8其中任意一种所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。


4.根据权利要求3所述的一种编码蔗糖异构酶突变体的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示的模板核苷酸序列通过PCR扩增得到，所述PCR扩增对应的正向引物分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13所示，对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：费颖，李舒宇，程慧君，樊启磊，
申请(专利权)人：苏州朗邦营养科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32