含不同截短PstS1融合蛋白AP的新型结核病亚单位疫苗的制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种含PstS1片段和Ag85A片段的融合蛋白和结核病亚单位疫苗。融合蛋白包括：第一肽段，所述第一肽段包含Ag85A片段；第二肽段，所述第二肽段包括PstS1片段，所述第一肽段与所述第二肽段相连；亚单位疫苗包括上述的融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白可同时激发机体的细胞免疫与体液免疫，提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力，该亚单位疫苗可有效的预防结核病。病。

【技术实现步骤摘要】
含不同截短PstS1融合蛋白AP的新型结核病亚单位疫苗的制备和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种含不同截短PstS1融合蛋白AP的新型结核病亚单位疫苗的制备和应用，更具体地，本专利技术涉及一种融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和亚单位疫苗及其应用。

技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的一种危害极大的慢性消耗性传染病，每年有900多万新发病例，死亡人数约140万。随着耐药结核分枝杆菌和艾滋病毒
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结核分枝杆菌(HIV
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TB)合并感染的出现，这一情况变得更加复杂，使得结核病的预后和治疗情况更加恶化。牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病，以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。其中以奶牛多发，严重影响了畜牧业的发展以及人类健康。
[0003]卡介苗(BCG)作为WHO目前唯一批准的预防结核病的疫苗，对婴儿及青少年具有保护作用，但是对成年人的保护作用并不明确，因此，亟需开发一种有效的结核疫苗。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种含PstS1片段和Ag85A片段的结核病亚单位疫苗，该亚单位疫苗可同时激发并提高细胞免疫与体液免疫，对结核病具有很好的预防效果。
[0005]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0006]目前针对结核病的疫苗有很多种，正在开发的新型结核疫苗包括重组BCG(rBCG)疫苗、减毒M.tb疫苗、佐剂亚单位蛋白疫苗、病毒载体疫苗、全细胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗等。
[0007]亚单位疫苗由于其易于生产、安全性好、特异性强、质量控制好等特点逐渐进入人们的视野。在有关重组亚单位疫苗抗原的筛选中，更倾向于选择能够诱导强烈的细胞免疫的抗原，但是研究证明多种细胞抗原的堆积对其免疫保护效果的提高并不明显。
[0008]基于此，专利技术人经过大量试验对重组亚单位疫苗抗原进行筛选，最终确定了Ag85A和磷酸盐特异性转运系统蛋白1(Phosphate transport system protein l，PstS1)两种蛋白。专利技术人发现，Ag85A是M.tb培养滤液蛋白的主要构成成分，也是M.tb的T细胞抗原，能够诱导极强的Th1型免疫应答，对调节细胞内感染很重要；PstS1是结核分枝杆菌细胞壁的重要蛋白，具有免疫原性，能刺激B细胞和T细胞的增殖，是一种重要的免疫保护性抗原。专利技术人发现，选择上述两种蛋白制得的融合蛋白，可同时激发细胞免疫与体液免疫，提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。专利技术人将上述的融合蛋白与佐剂制成结核病亚单位疫苗，并将其注射到小鼠体内，然后采用结核分枝杆菌对小鼠进行攻菌，结果发现小鼠脏器中的结核分
枝杆菌载量显著降低，几乎达到了与BCG相同的免疫保护力，说明该结核病亚单位疫苗可极大地提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力，可有效预防和治疗结核病。并且，专利技术人经过试验还发现，结核病亚单位疫苗可有效地加强BCG的免疫效应。
[0009]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种融合蛋白。根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白包括：第一肽段，所述第一肽段包含Ag85A片段；第二肽段，所述第二肽段包括PstS1片段，所述第一肽段与所述第二肽段相连。根据本专利技术实施例的融合蛋白可同时激发机体的细胞免疫与体液免疫，提高机体杀伤结核分枝杆菌的能力。
[0010]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种核酸分子。根据本专利技术的实施例，所述核酸分子编码前述的融合蛋白。根据本专利技术实施例的核酸分子可有效地表达前述的融合蛋白。
[0011]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，携带前述的核酸分子。根据本专利技术实施例的表达载体可有效地表达前述的融合蛋白。
[0012]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种重组细胞。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的融合蛋白。根据本专利技术实施例的重组细胞可用于前述的融合蛋白体外表达和大量获得。
[0013]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备亚单位疫苗中的用途。
[0014]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种亚单位疫苗。根据本专利技术的实施例，所述亚单位疫苗包括：前述的融合蛋白。根据本专利技术实施例的亚单位疫苗可提高机体抵抗结核分枝杆菌的能力，有效预防和治疗结核病；并且，还可有效地加强BCG的免疫效应。
[0015]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种前述的亚单位疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于加强BCG的免疫效应或者用于预防和/或治疗结核病。
[0016]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0017]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0018]图1为本专利技术实施例1中的AP1、AP2、AP3的SOE
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PCR扩增的凝胶电泳结果图；
[0019]图2为本专利技术实施例1中的pET
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21a
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Ag85A
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tnPstS1载体构建的模式图；
[0020]图3为本专利技术实施例1中的AP1、AP2、AP3纯化后的SDS
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PAGE考马斯染色图(左)及WB检测结果图(右)；
[0021]图4为本专利技术实施例3中的动物保护性试验流程图；
[0022]图5为本专利技术实施例3中攻菌后各组小鼠脏器细菌载量检测结果图，其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001；
[0023]图6为本专利技术实施例3中各组小鼠攻菌四周后肺部病理变化检测结果；
[0024]图7为本专利技术实施例4中三次免疫后各组小鼠血清抗体效价的变化结果；
[0025]图8为本专利技术实施例4中第三次免疫后的效价检测结果。
具体实施方式
[0026]下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0027]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0028]在本文中所披露的范围的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：第一肽段，所述第一肽段包含Ag85A片段；第二肽段，所述第二肽段包括PstS1片段，所述第一肽段与所述第二肽段相连。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连；或者所述第二肽段的C端与所述第一肽段的N端相连；任选地，所述Ag85A片段为Ag85A全长肽链；任选地，所述Ag85A片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1具有至少95％相似性的氨基酸序列；任选地，所述PstS1片段包括选自PstS1全长肽链和PstS1抗原表位肽中的至少之一；任选地，所述PstS1片段具有如SEQ ID NO:2～4任一项所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2～4任一项具有至少95％相似性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，进一步包括连接肽；任选地，所述连接肽的N端与所述第一肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连；或者所述连接肽的N端与所述第二肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第一肽段的N端相连；任选地，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)
n
，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选为2或3；任选地，所述连接肽包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；任选地，所述融合蛋白进一步包括标签；任选地，所述第一肽段的C端与所述第二肽段的N端相连，所述标签与所述第二肽段的C端相连或所述标签与所述第一肽段的N端相连；或者所述第二肽段的C端与所述第一肽段的N端相连，所述标签与所述第一肽段的C端相连或所述标签与所述第二肽段的N端相连；任选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，曾令媛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：