重组蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝纤维及其应用制造技术

本发明专利技术提供了重组蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝纤维及其应用。所述重组蜘蛛丝蛋白由不超过800个氨基酸组成，由N端至C端依次包括以下结构单元：N端结构域、重复序列单元、C端结构域、连接子、多肽标签；所述多肽标签能够自发地、特异性地与标签配体共价结合，所述重组蜘蛛丝蛋白不包含所述标签配体。本发明专利技术首次实现了人工合成蜘蛛丝成丝后功能生物大分子的修饰，无需对蜘蛛丝蛋白本身进行化学修饰或基因改造即可简单地实现蜘蛛丝的多功能化。本发明专利技术以功能化的重组蜘蛛丝作为载体实现了哺乳动物细胞的培养繁殖和生物矿化重组蜘蛛丝的合成。本发明专利技术可用于手术缝线、伤口敷料、伤口闭合系统、急救绷带、植入物、组织工程和细胞再生载体材料等医疗产品。疗产品。

【技术实现步骤摘要】
重组蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝纤维及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体而言，涉及重组蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝纤维及其应用。

技术介绍

[0002]在自然界中，很多材料都具有独特的性能。蜘蛛丝是一种来自自然界的高性能生物聚合物，具有超强的拉伸强度、高延展性、生物相容性、可生物降解性和低过敏性。蜘蛛可以生产多达七种不同用途的丝。在大壶腹腺和小壶腹腺合成的牵引丝蜘蛛丝蛋白(蛛丝蛋白)分别被称为MaSp和MiSp。通过对牵引丝的氨基酸组成和分子结构进行分析，总结出其具有三段结构，包括N端非重复结构域(NTD)、poly
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Ala、和Gly丰富的串联重复(Rep或R)、和C端非重复结构域(CTD)。蜘蛛丝蛋白在导管中保持为胶束，经过囊，从尾部挤出后形成纤维，此过程受pH值、剪切力、离子交换、脱水等因素的影响。
[0003]在过去的几十年里，基于天然蛛丝的生物传感器、手术缝合线、纺织品、光波导、伤口愈合、神经再生等方面的应用已经得到了研究。然而，由于低产量和蜘蛛同类相食的本性，基于类似于收获蚕丝蛋白的农业策略而大规模收获蜘蛛丝是不可能的，这限制了其工业应用。一种有望克服这一缺陷的方法是，在异种寄主体内产生重组蛛丝蛋白，并利用基因工程手段使其功能化。此前，已在哺乳动物细胞培养、细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中，以及在转基因哺乳动物的尿液和奶中生产了人造蛛丝，其缺陷包括蛋白质产量低和过早聚集导致的溶解度低。最近，美国2019/024847A1公开了一种高溶解度重组蛛丝蛋白，其在大肠杆菌表达中显示出高产量，并在丝制造过程中避免了使用尿素、甲酸、l,l,l,3,3,3
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六氟
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丙醇(HFIP)等强有机溶剂。然而，其没有对重组蛛丝蛋白赋予功能化。人造蜘蛛丝的应用主要是基于其机械性能的利用。重组蛛丝的功能化受限于与蛛丝蛋白功能基序的遗传整合，这通常会导致丝形成过程中蛋白质的聚集或分解。因此，利用人造蜘蛛丝作为一维生物相容性支架的巨大潜力仍有待开发。

技术实现思路

[0004]为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了重组蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝纤维及其应用。
[0005]具体而言，本专利技术提供了：
[0006](1)一种重组蜘蛛丝蛋白，由不超过800个氨基酸组成，其由N端至C端依次包括以下结构单元：N端结构域、重复序列单元、C端结构域、连接子、多肽标签；其中所述多肽标签能够自发地、特异性地与标签配体共价结合，其中所述重组蜘蛛丝蛋白不包含所述标签配体。
[0007](2)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签能够通过异肽键与所述标签配体结合。
[0008](3)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签能够通过Lys与Asp、Asn、
Glu、Gln或末端羧基之间形成的异肽键与所述标签配体结合，或者能够通过α
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氨基与Asp、Asn、Glu或Gln之间形成的异肽键与所述标签配体结合；优选地，所述多肽标签能够通过Asp与Lys之间形成的异肽键与所述标签配体结合。
[0009](4)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010](5)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述N端结构域和所述重复序列单元分别来自苗圃织网蜘蛛(Euprosthenops australis)的MaSpl蛋白的N端结构域和重复单元；优选地，所述N端结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重复序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011](6)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述C端结构域来自大腹园蛛(Araneus ventricosus)的MiSp蛋白的C端结构域；优选地，所述C端结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012](7)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列如式(GGGGS)n所示，其中n为大于1的整数。
[0013](8)根据(1)所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白在C末端具有组氨酸标签。
[0014](9)一种聚合纤维，其通过仿生纺丝法、由根据(1)
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(8)中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白形成，其中所述聚合纤维具有反应性的所述多肽标签。
[0015](10)一种缀合物，包含根据(1)
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(8)中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白或根据(9)所述的聚合纤维，以及具有一个或多个标签配体的配体蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白和所述聚合纤维的多肽标签与所述标签配体通过自发的、特异性的相互作用共价结合。
[0016](11)一种蛛丝组合物，包含根据(1)
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(8)中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白或根据(9)所述的聚合纤维，以及具有一个或多个标签配体的配体蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白或所述聚合纤维与所述配体蛋白分别独立地存在于分开的容器中，并且所述重组蜘蛛丝蛋白和所述聚合纤维的多肽标签能够自发地、特异性地与所述标签配体共价结合。
[0017](12)根据(10)所述的缀合物或根据(11)所述的蛛丝组合物，其中所述多肽标签能够通过异肽键与所述标签配体结合。
[0018](13)根据(10)所述的缀合物或根据(11)所述的蛛丝组合物，其中所述多肽标签能够通过Lys与Asp、Asn、Glu、Gln或末端羧基之间形成的异肽键与所述标签配体结合，或者能够通过α
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氨基与Asp、Asn、Glu或Gln之间形成的异肽键与所述标签配体结合；优选地，所述多肽标签能够通过Asp与Lys之间形成的异肽键与所述标签配体结合。
[0019](14)根据(10)所述的缀合物或根据(11)所述的蛛丝组合物，其中所述配体蛋白包括荧光蛋白、细胞外基质蛋白和生物矿化酶；其中所述荧光蛋白包括GFP、CFP、YFY和红色荧光蛋白；其中所述细胞外基质蛋白包括RGD肽和层粘连蛋白；其中所述生物矿化酶包括硅蛋白、碱性磷酸酶。
[0020](15)根据(10)所述的缀合物或根据(11)所述的蛛丝组合物，其中所述标签配体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
[0021](16)根据(10)所述的缀合物或根据(11)所述的蛛丝组合物，其中所述标签配体通过连接子分别与所述配体蛋白的N端和C端相连；优选地，所述连接子包含氨基酸序列如式
(VPGXG)
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所示的序列，其中X表示Val或Glu，并且使得在整个连接子中，该位点的Val与Glu的数目比为4:1。
[0022](17)一种制备聚合纤维的方法，包括以下步骤：
[0023]1)提供装有含根据(1)
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(8)中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白的溶液的挤出装置；
[0024]2)将步骤1)所述的溶液挤出到pH为4
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6的酸性缓冲体系中，并在其中保持至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蜘蛛丝蛋白，由不超过800个氨基酸组成，其由N端至C端依次包括以下结构单元：N端结构域、重复序列单元、C端结构域、连接子、多肽标签；其中所述多肽标签能够自发地、特异性地与标签配体共价结合，其中所述重组蜘蛛丝蛋白不包含所述标签配体。2.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签能够通过异肽键与所述标签配体结合。3.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签能够通过Lys与Asp、Asn、Glu、Gln或末端羧基之间形成的异肽键与所述标签配体结合，或者能够通过α
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氨基与Asp、Asn、Glu或Gln之间形成的异肽键与所述标签配体结合；优选地，所述多肽标签能够通过Asp与Lys之间形成的异肽键与所述标签配体结合。4.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述多肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述N端结构域和所述重复序列单元分别来自苗圃织网蜘蛛(Euprosthenops australis)的MaSpl蛋白的N端结构域和重复单元；优选地，所述N端结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重复序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述C端结构域来自大腹园蛛(Araneus ventricosus)的MiSp蛋白的C端结构域；优选地，所述C端结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。7.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列如式(GGGGS)n所示，其中n为大于1的整数。8.根据权利要求1所述的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白在C末端具有组氨酸标签。9.一种聚合纤维，其通过仿生纺丝法、由根据权利要求1
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8中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白形成，其中所述聚合纤维具有反应性的所述多肽标签。10.一种缀合物，包含根据权利要求1
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8中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白或根据权利要求9所述的聚合纤维，以及具有一个或多个标签配体的配体蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白和所述聚合纤维的多肽标签与所述标签配体通过自发的、特异性的相互作用共价结合。11.一种蛛丝组合物，包含根据权利要求1
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8中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白或根据权利要求9所述的聚合纤维，以及具有一个或多个标签配体的配体蛋白，其中所述重组蜘蛛丝蛋白或所述聚合纤维与所述配体蛋白分别独立地存在于分开的容器中，并且所述重组蜘蛛丝蛋白和所述聚合纤维的多肽标签能够自发地、特异性地与所述标签配体共价结合。12.根据权利要求10所述的缀合物或根据权利要求11所述的蛛丝组合物，其中所述多肽标签能够通过异肽键与所述标签配体结合。13.根据权利要求10所述的缀合物或根据权利要求11所述的蛛丝组合物，其中所述多肽标签能够通过Lys与Asp、Asn、Glu、Gln或末端羧基之间形成的异肽键与所述标签配体结合，或者能够通过α
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氨基与Asp、Asn、Glu或Gln之间形成的异肽键与所述标签配体结合；优选地，所述多肽标签能够通过Asp与Lys之间形成的异肽键与所述标签配体结合。14.根据权利要求10所述的缀合物或根据权利要求11所述的蛛丝组合物，其中所述配体蛋白包括荧光蛋白、细胞外基质蛋白和生物矿化酶；其中所述荧光蛋白包括GFP、CFP、YFY
和红色荧光蛋白；其中所述细胞外基质蛋白包括RGD肽和层粘连蛋白；其中所述生物矿化酶包括硅蛋白、碱性磷酸酶。15.根据权利要求10所述的缀合物或根据权利要求11所述的蛛丝组合物，其中所述标签配体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。16.根据权利要求10所述的缀合物或根据权利要求11所述的蛛丝组合物，其中所述标签配体通过连接子分别与所述配体蛋白的N端和C端相连；优选地，所述连接子包含氨基酸序列如式(VPGXG)
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所示的序列，其中X表示Val或Glu，并且使得在整个连接子中，该位点的Val与Glu的数目比为4:1。17.一种制备聚合纤维的方法，包括以下步骤：1)提供装有含根据权利要求1
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8中任一项所述的重组蜘蛛丝蛋白的溶液的挤出装置；2)将步骤1)所述的溶液挤出到pH为4
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6的酸性缓冲体系中，并在其中保持至少24小时。18.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙飞，蒋博静，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：