一种抗CD20的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD20的纳米抗体，该抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及一种CD20嵌合抗原受体蛋白，从N端到C端依次为：信号肽、本发明专利技术的纳米抗体(VHH)、StrepII标签、铰链

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD20的纳米抗体及其应用

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[0001]本专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体地，本专利技术涉及一种靶向CD20纳米抗体、含有该纳米抗体序列的嵌合抗原受体及表达该嵌合抗原受体的T细胞(CAR
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T细胞)，其可用于肿瘤细胞免疫治疗。

技术介绍

[0002]CD20属于非糖基化磷蛋白，能够调节B淋巴细胞的增殖和分化。CD20在大部分正常组织中表达受限，仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞和激活的B淋巴细胞中表达。然而，CD20高表达是B细胞淋巴瘤的重要分子特征，其在超过95％的B细胞淋巴瘤中高表达，而且容易被抗体识别结合，因此CD20是B细胞淋巴瘤理想的治疗靶点。
[0003]纳米抗体又称单域抗体，由骆驼科动物(包括骆驼、羊驼及其近亲物种)缺失轻链的天然重链抗体的可变区(VHH)组成，与普通抗体相比，纳米抗体除了缺少轻链之外，其重链可变区与铰链区之间没有CH1区，只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体具有分子量小，亲和力和稳定性高、免疫原性较低、可溶性高和穿透力强等特性，目前广泛用于抗体免疫及细胞免疫治疗。
[0004]嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR
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T)是一种人工修饰的T淋巴细胞。CAR结构从N端到C端依次包括抗体结合区、铰链
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跨膜区、共刺激结构域以及激活结构域。因此CAR
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T细胞同时具有抗体的靶向作用和T淋巴细胞的效应杀伤能力。CAR
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T细胞疗法已经在一部分血液肿瘤治疗中取得了突破性进展，目前已有多款CAR
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T细胞产品获批上市。然而，目前嵌合抗原受体的研究还有一些不足，在CAR
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T细胞治疗中存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种靶向CD20的纳米抗体，嵌合抗原受体、CAR
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T细胞及应用；所述靶向CD20的纳米抗体及嵌合抗原受体能够特异性结合CD20抗原，所述靶向CD20的CAR
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T细胞可以靶向杀伤CD20高表达的肿瘤细胞。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种抗人CD20纳米抗体，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。其框架区为SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:3所示的FR2，SEQ ID NO:4所示的FR3，SEQ ID NO:5所示的FR4；其互补决定区为SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:7所示的CDR2，SEQ ID NO:8所示的CDR3。
[0007]在本专利技术的第二方面，提供了一种核酸，编码所述的SEQ ID NO:1纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。根据本专利技术的实施例，所述核酸为编码前面所述纳米抗体的核酸或其互补序列。根据本专利技术实施例的核酸特异性编码前面所述的纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性靶向结合CD20。
[0008]需要说明的是，对于本专利技术权利要求书和说明书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本权利要求书和说明
书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
[0009]在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种靶向CD20的嵌合抗原受体，其特征在于，从N端到C端包括顺次连接的CD8a信号肽、纳米抗体、StrepII标签、CD8a铰链区,CD28跨膜区、CD28功能区，4
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1BB功能区和CD3ζ功能区，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
[0010]在本专利技术的第四方面，本专利技术提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
[0011]在本专利技术的第五方面，本专利技术提供了一种靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞。
[0012]本专利技术提供的所述的纳米抗体、编码所述纳米抗体的基因、所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的基因、所述的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的靶向CD20的纳米抗体序列与CD20抗原有较强的结合能力。本专利技术制备的靶向CD20的嵌合抗原受体T细胞对CD20阳性的肿瘤细胞有较强的杀伤作用
附图说明
[0014]表1显示实施例的免疫后羊驼血清中CD20纳米抗体ELISA检测效价结果图。
[0015]表2显示CD20纳米抗体噬菌体ELISA结果图。
[0016]图1为CAR质粒图谱；
[0017]图2为嵌合抗原受体结构示意图；
[0018]图3为CAR表达率流式检测结果；
[0019]图4为CAR
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T细胞对CD20阳性细胞杀伤效果检测结果。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供了一种靶向CD20的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
[0021]RRQLVESGGGLVQPGGSLTLSCVASGSFFSIYGSSWYRQVPGKQRELVA SINRSGVTDYTDSVKGRFTISRDNAGNTWWLQMNSLKPEDTAVYYCNARRL WRDYWGQGTQVTVSS。
[0022]本专利技术中，所述纳米抗体2A11包括4个框架区和3个互补决定区；其框架区为SEQ ID NO:2所示的FR1区，SEQ ID NO:3所示的FR2区，SEQ ID NO:4所示的FR3区，SEQ ID NO:5所示的FR4；其互补决定区为SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:7所示的CDR2，SEQ ID NO:8所示的CDR3。
[0023]所述框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
[0024]RRQLVESGGGLVQPGGSLTLSCVASG。
[0025]所述框架区FR2氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
[0026]WYRQVPGKQRE。
[0027]所述框架区FR3氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
[0028]DSVKGRFTISRDNAGNTWWLQMNSLKPEDTAVYYC。
[0029]所述框架区FR4氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：
[0030]WGQGTQVTVSS。
[0031]所述互补决定区CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体如下：
[0032]SFFSIYGSS。
[0033]所述互补决定区CDR2氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，具体如下：
[0034]L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CD20的抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为纳米抗体。3.一种核酸，其特征在于，所述核酸为：编码权利要求1所述抗体的核酸或其互补序列。4.一种核酸，其特征在于：所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示或者SEQ ID NO:9所示序列的互补序列。5.一种靶向CD20的嵌合抗原受体，其特征在于，从N端到C端依次为信号肽、权利要求1或2所述的抗体、StrepII标签、铰链
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跨膜区、至少一个共刺激结构域以及激活结构域。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：