LIPUS对三维支架材料上MC3T3‑E1细胞内RNA表达影响的研究方法技术

本发明专利技术提供一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3‑E1细胞内RNA表达影响的研究方法，包括：将MC3T3‑E1细胞接种到三维支架材料上；将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3‑E1细胞的培养基；停止加载LIPUS后，收集材料上的MC3T3‑E1细胞，进行全转录组和miRNA的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA，并结合GO和KEGG进行整合分析。本发明专利技术为后续研究LIPUS促进三维材料内成骨分化的分子生物学机制提供可靠数据和新的研究思路。

Study on the method of LIPUS MC3T3 three-dimensional scaffolds in E1 cells the expression of RNA

The invention provides a LIPUS of three-dimensional scaffolds MC3T3 E1 intracellular RNA expression of MC3T3 method: E1 cells were seeded onto three-dimensional scaffolds; 3D scaffolds after vaccination and probe into the water, keep the ultrasonic probe and the material from the material at the bottom of distance is 5cm. Loading LIPUS, loading process every 2 to 3 days to replace a MC3T3 E1 cell culture medium; stop after loading LIPUS, the collection of materials on the MC3T3 E1 cells, high-throughput sequencing of whole transcriptome and miRNA screening, differential expression of mRNA and lncRNA, miRNA, and the combination of GO and KEGG integration analysis. The invention provides reliable data and new research ideas for further studying the molecular biological mechanism of LIPUS promoting osteogenic differentiation in three-dimensional materials.

【技术实现步骤摘要】
LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法。
技术介绍
低强度脉冲超声波(low-intensitypulsedultrasoundstimulation，LIPUS)是一种使用频率和剂量较低的超声波。有文献报道：LIPUS有利于体外三维材料内骨髓间充质干细胞的成骨向分化、促进兔股骨多孔材料内的血管化和骨形成、可提高兔脊椎与多孔材料间的骨融合率[1-3]。还有文献报道：LIPUS可以明显促进成骨细胞在多孔材料内的长入、增殖和早期分化[4，5]；LIPUS与人工骨材料联合修复Beagle犬节段性骨缺损可提高新骨形成速度及骨组织密度，缩短骨愈合时间[6]。本课题组与中科院金属研究所合作的国家“863”计划项目：2015AA033702高强韧多孔钛人工骨材料研发，对利用电子束逐层熔化技术三维打印制备的多孔钛合金(Ti-6Al-4V，ELI粉，医疗外科植入用)材料的生物学性能进行了全面评价，实验发现LIPUS可以促进钛合金多孔材料内MC3T3-E1细胞的分化和长入，对细胞的增殖无明显影响[7]；动物实验结果是在兔下颌骨大面积骨缺损修复过程中，LIPUS促进了钛合金多孔材料内的骨形成和骨成熟。以上数据均提示LIPUS可以提高多孔人工骨材料修复骨缺损的疗效，“超声波+多孔材料”方法应用于大面积骨缺损修复具有可行性。但到目前为止，对于超声波促进骨愈合机制的研究基本上都是基于二维空间[8]，基于三维空间的研究尚未见报道。但是基于二维空间阐述的机制不能用于解释三维支架上的实验结果。超声波在三维支架材料内的传播非常复杂，完全不同于二维空间，并且骨缺损修复本身就是对缺损三维空间的修复过程，因此LIPUS对三维支架材料内骨愈合的作用机制的探索具有重要意义。越来越多的证据表明非编码RNA，特别是长链非编码RNA(longnoncodingRNA，1ncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)参与调控成骨分化[9，10]，而1ncRNA和miRNA之间的相互调控关系是发挥作用的重要形式[11]。1ncRNA调控miRNA的作用机制中最主要的是竞争性内源RNA(competitiveendogenousRNA，ceRNA)途径，即lncRNA竞争结合具有相同miRNA应答元件的miRNA，发挥内源性“miRNA海绵”功能，抑制该miRNA表达及对靶基因的负向表达调控[12]。ceRNA是一种全新的基因表达调控模式，相比其它调控网络，更为精细和复杂[13]。但现有关于LIPUS对三维支架材料内骨愈合的作用机制的探索主要集中在NF-κβ1、p38α、m-TOR[14]、MAPK[15]、α5β1/PI3K/Akt[16]、ROCK-Cot/Tpl2-MEK[17]这些通路，且这些研究都是基于二维空间阐述的机制，不能用于解释三维支架上的实验结果。现在还未见LIPUS对三维支架材料内成骨机制有关转录组学非编码RNA方面的研究，所以对于LIPUS对三维支架材料内成骨机制在转录组学非编码RNA方面的探索具有非常重要的意义。参考文献：1.ZhouX，CastroNJ，ZhuW，CuiH，AliabouzarM，SarkarK，ZhangLG.Improvedhumanbonemarrowmesenchymalstemcellosteogenesisin3Dbioprintedtissuescaffoldswithlowintensitypulsedultrasoundstimulation.SciRep，2016，6：32876.2.YanH，LiuX，ZhuM，LuoG，SunT，PengQ，ZengY，ChenT，WangY，LiuK，FengB，WengJ，WangJ.Hybriduseofcombinedandsequentialdeliveryofgrowthfactorsandultrasoundstimulationinporousmultilayercompositescaffoldstopromotebothvascularizationandboneformationinbonetissueengineering.JBiomedMaterResA，2016，104(1)：195-208.3.HuiCF，ChanCW，YeungHY，LeeKM，QinL，LiG，LeungKS，HuYY，ChengJC.Low-intensitypulsedultrasoundenhancesposteriorspinalfusionimplantedwithmesenchymalstemcells-calciumphosphatecompositewithoutbonegrafting.Spine，2011，36(13)：1010-1016.4.WuL，LinL，QinYX.Enhancementofcellingrowth，proliferation，andearlydifferentiationinathree-dimensionalsiliconcarbidescaffoldusinglow-intensitypulsedultrasound.TissueEngPartA，2015，2(1-2)：53-61.5.秦丽梅，吴琳.低强度脉冲超声波作用下羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上成骨细胞的生物学行为的研究.生物医学工程与临床，2014，18(6)：517-522.6.胡莹，刘笑涵，王靖宇，吴琳，高勇，张劲松.低强度脉冲超声波辐照与泡沫TiC/Ti对犬节段性骨缺损修复的促进作用.中国比较医学杂志，2013，23(4)：44-47.7.CaoHJ，FengLF，WuZX，HouWT，LiSJ，HaoYL，WuL.Effectoflow-intensitypulsedultrasoundonthebiolodicalbehaviorofosteoblastsonporoustitaniumalloyscaffolds：aninvitroandinvivostudy.MaterSciEngCMaterBiolAppl，2017，80：7-17.8.PadillaF，PutsR，VicoL，GuignandonA，RaumK.Stimulationofbonerepairwithultrasound.AdvExpMedBiol，2016，880：385-427.9.HuangY，ZhengY，JiaL，LiW.LongnoncodingRNAH19promotesosteoblastdifferentiationviaTGF-β1/Smad3/HDACsighalingpathwayderivingmiR-675.StemCells，2015，33(12)：3481-3492.10.HeP，ZhangZ，HuangG，WangH，XuD，LiaoW，KangY.miR-141modulatesosteoblasticeellproliferationbyregulatingthe本文档来自技高网...

【技术保护点】
LIPUS对三维支架材料上MC3T3‑E1细胞内RNA表达影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将MC3T3‑E1细胞接种到三维支架材料上；(2)将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载参数为：超声频率1～3.3MHz，强度10～100mW/cm

【技术特征摘要】
1.LIPUS对三维支架材料上MC3T3-E1细胞内RNA表达影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将MC3T3-E1细胞接种到三维支架材料上；(2)将接种完毕的三维支架材料和超声探头浸入水中，保持超声探头和材料的距离为5cm，从材料底部加载LIPUS，加载参数为：超声频率1～3.3MHz，强度10～100mW/cm2，10～30min/次，1次/d，加载周期为1～21d，加载过程中每2～3天更换一次MC3T3-F1细胞的培养基；(3)停止加载LIPUS后，收集材料上的MC3T3-E1细胞，进行全转录组和miRNA的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncR...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴琳，刘洁，冯丽芳，曹洪娟，刘笑涵，
申请(专利权)人：中国医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21