一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，包括以下步骤：配制质量百分比浓度为20％的P(MVE-alt-MAH)水溶液，取质量百分比浓度为10％的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE-alt-MAH)水溶液中，调节pH为5-6，反应加入1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化；再加N-羟基琥珀酰亚胺反应(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联；(4)滴入PBS溶液，将多余小分子脲吸出去除，即得。硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和密集的大型孔洞利于细胞的黏附生长。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备技术，特别涉及一种用P (MVE-alt-MAH)交联剂交联法制备得到的多个硬度梯度大孔改性蛋清细胞培养支架材料的方法。
技术介绍
乙烯基甲醚/马来酸酐共聚物P (MVE-alt-MAH)，又称乙烯甲醚-马来酸酐共聚物(甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物，甲氧基乙烯/马来酸酐共聚物)，是水溶性电解质聚合物，是人工合成化合物中少数几种的对人体和动物无毒无害的物质。因产品具有良好的化学稳定性、低毒性、生物相容性、络合性、螯合性、粘合性、凝聚性、成膜性、兼有亲水和疏水的独特性能，该产品在现代工业中有广泛的用途，可以起到分散剂、偶联剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂、增溶剂、缓蚀剂、成膜剂和抗静电剂的作用。可以作为交联剂，制备具有大孔结构的高分子材料。组织工程支架材料是指替代细胞外基质使用的生物相容性医学材料。除要考虑材料的组织相容性外，还要考虑力学相容性一粘弹性，合适的三维立体结构。孔隙率应该达到90%以上，有较大的比表面积，有利于黏附细胞，容纳细胞因子、营养物质，同时具有均匀分布和互相连通的孔结构，有利于细胞在整个支架体内部形成网络分布，有利于代谢废物的排出和血管神经的长入，保证再生组织具有三维有机结构。蛋清含有细胞生长发育所需要的全部营养和信号成分，是一种以水作为介质，以蛋白作为分散相的胶体物质，约占鸡蛋总重的60%?63%。其中的85%?89%为水分，而剩余的固形物中，约有80%的蛋白质，其力学性能及形貌有较大范围的可改性调节。通过对蛋清培养支架材料采用不同方式改性，用于研宄不同的材料硬度和形貌微环境对细胞行为的影响。P (MVE-alt-MAH)和蛋白质的酰胺化反应通过1_乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂和催化剂得以进行。以10mg/ml的EDC活化羧基15-20min，pH5.0，然后用10mg/ml NHS来激活反应15_20min。调节ρΗ7.2左右加入蛋白，37°C反应12h。偶联时EDC反应的最佳条件是pH 4.5 (或者在4_6范围之间)，使用精密PH试纸测定。反应时间6h以上，延长到12h会更好。反应完应把小分子量的脲除掉。酰胺键偶合在弱碱条件下进行:1.称NHS与反应容器中。(NHS稳定性比EDC好)2.称EDC。(这步要快，EDC在空气中会受潮水解，尽量使用5倍Sulfo-NHS摩尔以上的量)3.加入PBS buffer ο 4.用NaHC0310%或者NaOH(IM)将pH调至中性反应。EDC/NHS是把两种物质的_順2和-COOH交联起来。COOH与EDC反应，反应后的物质再与NH 2反应，中间NHS是加速反应EDC很容易失活，半衰期只有120min，要注意马上使用，并且防潮。EDC起到了一个活化羧基的作用，EDC能够和羧基反应形成一个中间物，然后这个中间物再与氨基作用，使得氨基和羧基反应形成相应的共价键。NHS的作用就是稳定这个中间物，减少副反应的发生。蛋白质化学交联是一类重要化学修饰反应，所用交联剂为含有双功能基团的化学试剂。化学交联型具有良好的力学性能和稳定性。因为P (MVE-alt-MAH)天然安全无毒副作用，所以是目前研宄的热点，可用于生物医学组织工程高分子的交联改性制备大孔支架材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了提供，工艺简单，周期短，且适用于批量生产。本专利技术的另一个目的在于提供一种新型改性蛋清细胞培养支架材料，交联度均匀，表面多皱褶或多大孔，形貌结构统一。本专利技术提供的技术方案如下:，包括以下步骤:(I)配制质量百分比浓度为20%的P (MVE-alt-MAH)水溶液，取0.025?0.2g的P (MVE-alt-MAH)水溶液加入反应器皿中；(2)取质量百分比浓度为10%的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P (MVE-alt-MAH)水溶液中，调节PH为5-6，反应10-15min ;加入1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺活化15-20min ;再加N-羟基琥珀酰亚胺反应15_20min ；1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1;(3)调节pH7.2，再加入2mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25?37°C下充分交联反应完全；(4)将步骤(3)得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复若干次；(5)反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌即获得用于细胞培养的大孔改性蛋清培养支架材料。第(5)步得到的大孔改性蛋清培养支架材料进一步制备成冻干粉末。第⑷步重复若干次是指的用PBS溶液重复三次，每次12h洗涤去除多余及未交联的小分子脲。所紫外照射杀菌为超净台内紫外光照不超过30min。根据权利要求1所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，基于所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，将大孔改性蛋清细胞培养支架移入六孔板中，向每孔加入0.4mL事先准备好的SK0V3卵巢癌细胞悬液，细胞浓度为5X104cellS/mL，细胞数量每孔不低于5X 14个；在培养过程中，小于等于7天的培养时间，采用连续追加培养液法进行培养；大于等于15天以上的培养期，则采用每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。所述的基于大孔改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，所用的细胞悬液为SK0V3卵巢癌贴壁细胞。所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到的冻干粉末的应用，将制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末添加到正在贴壁培养瓶或皿里，短期培养后用以实现材料和细胞的分离。有益效果本专利技术所述的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，可灵活使用。制备好的大孔改性蛋清细胞培养支架材料可进一步制成冻干粉末，添加到正在贴壁对数生长期的贴壁细胞培养瓶(皿)里，短期培养后，易于实现材料和细胞的分离，研宄材料对细胞行为的影响。本专利技术所制备的新型改性蛋清细胞培养支架材料，硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和孔洞利于细胞的黏附生长。各孔洞互为贯通，有利于营养和氧气、代谢物的交换排出，也利于细胞向材料内部生长，提高细胞培养密度。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。【附图说明】图1是本专利技术实施例1、2、3、4、5获得的大孔改性蛋清细胞培养支架材料的冻干扫描电镜图；本专利技术制备得到大孔改性蛋清细胞培养支架材料表面皱褶、多孔，形貌结构统一。其中，各图显示了 P(MVE-zlt-MAH)完全交联后的蛋清的形貌变化。(a)0.2gP(MVE-zlt-MAH)处理；(b)0.15g P (MVE-zlt-MAH)处理；(c)0.1g P (MVE-zlt-MAH)处理；(d)0.05g P (MVE-zlt-MAH)处理；(e)0.025g P (MVE-zlt-MAH)处理。图2蛋清P (MVE-zlt-MAH)交联后流变学变化特征。可以看出，随交联剂量增加，支架材料的粘弹性总体有增大的趋势。2mL蛋清P(MVE-zlt-MAH)交联后流变学变化特征。(a) 0.2g P (MVE-zlt-MA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大孔改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）配制质量百分比浓度为20%的P(MVE‑alt‑MAH)水溶液， 取0.025~0.2g的P(MVE‑alt‑MAH)水溶液加入反应器皿中；（2）取质量百分比浓度为10%的碳酸氢钠溶液，缓慢滴加到P(MVE‑alt‑MAH)水溶液中，调节pH为5‑6，反应10‑15 min；加入1‑乙基‑（3‑甲基氨基丙基）碳酰二亚胺活化15‑20 min；再加N‑羟基琥珀酰亚胺反应15‑20 min；1‑乙基‑（3‑甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1；（3）调节pH7.2，再加入2 mL鸡蛋清进行交联，充分振荡或搅拌后静置，25~37℃下充分交联反应完全；（4）将步骤（3）得到的改性蛋清培养支架材料用注射器逐滴滴入PBS溶液，静止12 h，使其中的多余小分子脲吸出去除，重复若干次；（5）反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌即获得用于细胞培养的大孔改性蛋清培养支架材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张天柱，郭振超，杨新明，顾宁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32