抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架，是以支架材料PCL-PLA为基础，光接枝聚丙烯胺、IGF和TNF-a进行协同共修饰得到。本发明专利技术以三维支架材料为基础，实现了带正电荷材料和双重生长因子的共修饰，制备的PCL-PLA组织工程复合支架（PCL-PLA-PAAm-IGF/TNF-α）不仅具有显著的抗细胞衰老作用，同时更有利于细胞附着于支架生长，为细胞形成组织，甚至器官提供了可能。本发明专利技术实现了在三维支架上培养细胞，更加符合人体细胞生活的内环境，细胞生长状态明显提高，对临床上的运用更具有实际意义，对于肝组织工程的研究具有积极的促进作用，也为组织工程中研究抗细胞衰老提供了方向。

【技术实现步骤摘要】
抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的制备和应用
本专利技术属于生物材料
更具体地，涉及一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的制备和应用。
技术介绍
肝脏是人体内最大的实质性器官，也是机体最重要的生命器官之一。在体内发挥着包括消化、解毒、合成、分泌等重要的生理功能，同时担负着凝血、免疫、新陈代谢、产热及水电解质平衡等一系列复杂的生理功能。我国是慢性肝病的高发地区，其发病率和死亡率均较高，急、慢性肝病，尤其是肝衰竭和肝癌，严重威胁人类生命健康。目前，肝移植仍然是多种肝脏疾病唯一可行的治愈方法，但是临床应用中往往存在着器官短缺、肝脏供体紧缺、技术复杂、成本昂贵等种种难题。因此，用组织工程方法构建出人工肝脏是临床医学和材料研究者们的共同追求的目标。但是肝组织工程的发展依然需要克服一系列技术挑战。组织工程三要素包括种子细胞、细胞外基质材料（支架材料）以及组织与器官的构建与再生。肝组织工程以支架结构为评价重点，对肝组织工程支架进行仿生设计或者修饰，结合现代科学技术制备多孔支架。搭建体外动态培养平台，将肝细胞种植于支架上，进行体外动态培养，并通过形态学、功能学检测方法评价了新型三维支架对肝细胞生长分化的促进作用，有望应用于组织工程肝的构建。对于肝组织工程，因其本身属于软组织，所以对材料的力学性质并无太大要求，但肝脏系统是一个高度管道化的复杂性代谢器官，制备适合的细胞外基质材料和如何将支架细胞复合体内的营养物质、代谢物进行转运，是一个关键性问题。所以对材料的性能和结构有特殊的要求：（1）支架材料必须具有可生物降解性和生物相容性，降解产物不应有毒和引起炎症；（2）材料具有可加工性以及孔隙的大小和孔隙率可调控，以适应精细制造工艺，为预血管化和血管生成创造条件；（3）支架材料应有足够的表面积用于细胞粘附，也应有足够的空间使细胞集落扩展，增殖。从肝组织工程需要考虑，目前肝组织工程支架材料有两类，一类是天然基质材料如胶原，纤维连接蛋白，层连蛋白，透明质酸，海藻酸钠，壳聚糖。它们均有较好的生物相容性，但其形成的支架材料，难有好的稳定性和机械性能，缺乏可加工性；而肝细胞结构的复杂性要求材料需要可加工性，这给天然基质的应用造成了障碍。另一类是合成高分子聚合物如PGA，PLA等其生物降解性好，有良好的力学性能，降解速度可控等优点，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。目前，肝组织工程支架材料仍然处于筛选阶段。因此，研究者们为了解决以上材料问题，采用了复合、修饰和改性的方法，扬长避短，借以获得一种良好的生物材料，这些修饰可为种植于其上的细胞提供更合适的环境因素、生长因子以至于诱导新生血管形成的预血管化位点和多孔结构，具体复合、修饰和改性方法主要有：材料复合、在生物材料表面固定蛋白质进行表面修饰、在生物材料表面固定多肽进行修饰、在生物材料表面引进碳氢化合物进行修饰、在生物材料表面进行尺寸和形状特征修饰等。运用材料复合的方法，是为了使各种材料的优缺点互补，这类的复合国内外文献比较多，比如徐星等人制备的胶原/壳聚糖/肝素复合物；Tack等人制备的海藻酸钠/半乳糖基化壳聚糖支架材料，相对于单纯的支架材料，无论在各方面都取得不错的效果。通过在材料表面引进某些物质，通过肝细胞的特异表面受体的认知，来增加细胞的黏附、扩展，蛋白如抗体、肽以及寡肽是通过和聚合物一系列的相互作用来固定。但是由于这些物质的易变性，所以其溶剂和处理条件都比较苛刻。由王军等人制备的蛋白改性壳聚糖用于肝细胞培养，发现肝细胞粘附率提高，细胞存活率增加，肝细胞功能的表达也达到了一定的水平。另外，细胞外基质蛋白包括纤维蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白、层连蛋白以及用于聚合物包覆的细胞结合和黏附因子，而位于这些蛋白上的受体包含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。而RGD可以与整联蛋白受体相互作用，因此聚合物通过表面的RGD与整联蛋白相互作用，可增强细胞的黏附，但是将多肽固定在材料表面，由于空间阻碍而降低肽的活性，通过添加氨基酸的残基或其他基团，将肽固定在材料，可以改变肽原来的功能，表现在肽活性的降低，所以在添加肽的时候应注意添加基团的溶解度，复合物的二级结构，三级结构以及空间阻碍。通过在材料表面引进碳氢化合物，增加细胞的黏附。如引进半乳糖，进行肝细胞特异受体来增加肝细胞的粘附率，如由JUNYang制备出的半乳糖基化海藻酸盐支架材料，引进了碳氢化合物半乳糖基，用于肝细胞培养，结果发现由于半乳糖的引进，有球形肝细胞体形成。最后一种表面修饰方法即在生物材料表面进行尺寸和形状特征修饰，将底物表面制成具有一定尺寸和形状如腔、槽等的特征性结构，模仿微环境。Junji等人用微制造和微打印技术，将胶原/聚乙二醇复合物支架材料制成了具有微圆柱状槽的形态，直径大约300μm，密度大约有每平方厘米700个槽，槽的底部分为两个不同的区域，支持细胞粘附的和不支持细胞粘附，在槽底部大约100μm区域内用胶原覆盖，形成细胞粘附区，其他则用聚乙二醇改性，种植肝细胞发现有球状肝细胞体出现，细胞呈立方体形状和体内相同，其肝细胞功能也表达良好。生物材料科学是组织工程中的重要环节，材料组成、支架制备过程和支架结构三个重要因素共同组成了支架材料的金三角，他们之间相互作用，共同决定支架性能，缺一不可。组织工程材料是细胞粘附和增殖的载体，理想的支架材料应该满足以下条件：（1）支架内部是连通的孔洞结构，能达到一定的孔隙率，为培养液的流动和细胞代谢物的排出提供有利条件；（2）支架材料可吸收或可降解，并且与细胞或组织生长的速率相匹配；（3）材料内部孔洞结构可为细胞的粘附和增殖提供足够的面积；（4）材料的机械性能与组织本身的性能相一致；（5）材料易于加工成型，吸附率和存活率，功能表达也明显增加。因此，支架材料的选择，以及其与活性因子的匹配或结合作用，是组织工程生物材料制备首要考虑的问题。现今，肝组织工程研究尚处于起步阶段，还存在许多问题，如选择异种肝细胞将面临免疫排斥和异种病毒感染；生物反应器中细胞培养的血管化；组织、器官体外培养和构建等方面等难题。人工肝的功能表达要求各种功能细胞共培养和各类生长因子协调作用等问题亟待解决。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有肝组织工程生物材料的不足，提供一种新型的、具有明显的抗肝细胞衰老作用的肝组织工程光接枝材料。本专利技术的目的是提供一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架。本专利技术另一目的是提供上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的制备方法。本专利技术再一目的是提供上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架，是以支架材料PCL-PLA为基础，光接枝聚丙烯胺（PAAm）、IGF和TNF-a进行协同共修饰得到。具体地，上述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架是由如下步骤制备得到：S1.利用PBS溶液分别溶解IGF和TNF-a，得到游离IGF溶液和游离TNF-a溶液；S2.在游离IGF溶液和游离TNF-a溶液中分别加入DMF/PBS溶液进行反应，再分别加入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液进行反应，得到光活性IGF溶液和光活性TN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肝细胞衰老的PCL‑PLA组织工程复合支架，其特征在于，是以支架材料PCL‑PLA为基础，光接枝聚丙烯胺、IGF和TNF‑a进行协同共修饰得到。

【技术特征摘要】
1.一种抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架，其特征在于，是以支架材料PCL-PLA为基础，光接枝聚丙烯胺、IGF和TNF-a进行协同共修饰得到；具体是由如下步骤制备得到：S1.利用PBS溶液分别溶解IGF和TNF-a，得到游离IGF溶液和游离TNF-a溶液；S2.在游离IGF溶液和游离TNF-a溶液中分别加入DMF/PBS溶液进行反应，再分别加入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液进行反应，得到光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液；S3.把DMF/PBS溶液溶解的聚丙烯胺与叠氮苯胺盐酸盐进行反应，得到光活性PAAm；S4.剪裁支架材料PCL-PLA，PBS清洗后，加入光活性PAAm进行光接枝，再加入光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液，进行光接枝，得到PCL-PLA组织工程复合支架。2.根据权利要求1所述抗肝细胞衰老的PCL-PLA组织工程复合支架，其特征在于，由如下步骤制备得到：S1.利用PBS溶液分别溶解IGF和TNF-a，得到游离IGF溶液和游离TNF-a溶液，分别过滤灭菌；S2.共固定IGF和TNF-a的制备S21.步骤S1所述游离IGF溶液和游离TNF-a溶液中分别加入体积比4:1的DMF：PBS，磁力冰浴搅拌反应后，超滤；S22.避光环境下将S21处理后的IGF与TNF-α分别加入含N-琥珀亚酰胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液中，磁力冰浴搅拌反应后，分别超滤纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，得到光活性IGF溶液和光活性TNF-a溶液；S3.共固定聚丙烯胺的制备S31.利用体积比4:1的DMF：PBS溶液溶解聚丙烯胺，磁力冰浴搅拌反应后超滤；S32.避光环境下，把S31处理后的聚丙烯胺与叠氮苯胺盐酸盐按物质的量1:100加入棕色瓶进行反应，磁力冰浴搅拌反应后，超滤纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，得到光活性PAAm；S4.支架材料的制备S41.将支架材料PCL-PLA剪裁成1厘米见方大小，用灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：关燕清，杨润财，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44