一种工程化牙周组织的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种工程化牙周组织的制备方法，用于牙周组织重建。该牙周组织由牙周膜干细胞及其分泌合成的细胞外基质构成，即，先将牙周膜干细胞经扩增培养，形成复层化的牙周膜干细胞聚合体，再将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置并塑形，形成工程化牙周组织。本发明专利技术之牙周组织，在体内可形成新的牙周结构，使得牙周缺损得以再生。该牙周组织具有制备简便、可塑性强、细胞密度适宜、细胞外基质含量丰富、无需支架材料、体外培养时间短等优点。

Preparation method of Engineering periodontal tissue

The invention relates to a preparation method of an engineering periodontal tissue, which is used for periodontal tissue reconstruction. The periodontal tissue by periodontal ligament stem cells and the secretion of extracellular matrix synthesis, i.e., the cells were cultured periodontal ligament stem, formation of periodontal ligament stem cell aggregates, then multiple periodontal ligament stem cells are stacked and polymer plastic forming engineering periodontal tissue. The periodontal tissue of the invention can form a new periodontal structure in the body so that periodontal defects can be regenerated. The periodontal tissue has the advantages of simple preparation, strong plasticity, proper cell density, rich content of extracellular matrix, no need of scaffold material and short time in vitro culture.

【技术实现步骤摘要】
一种工程化牙周组织的制备方法
本专利技术属于组织工程
，具体涉及一种用于牙周组织重建与再生的工程化牙周组织的制备方法。
技术介绍
牙周炎是一种口腔常见病，其病理特点为牙周附着的丧失及牙槽骨的退缩，病变过程累及牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质等牙齿的支持组织，最终导致牙齿的脱落，给患者带来极大痛苦。因此，探索牙周组织再生的方法，对促进牙槽骨及牙周膜的再生，具有非常重要的临床意义。目前临床上应用的促使牙周再生的方法主要有两种，骨或生物活性材料移植以及诱导组织再生术（guidedtissueregeneration，GTR）。然而，使用自体骨移植或者生物活性材料虽然能在骨内袋中有新骨的形成，但是组织学并未证实这些部位同时形成牙骨质和结缔组织的新附着；GTR技术是在常规牙周翻瓣并进行根面平整治疗后，利用生物膜将根面与骨膜瓣分开，防止上皮和龈结缔组织长入，从而促进牙周膜细胞分化进一步再生牙周组织，但GTR治疗后普遍反映再生牙周组织量不够。因此目前临床再生牙周组织的方法疗效不佳，均不能实现真正的牙周组织再生。目前应用组织工程与再生医学的技术促进组织再生的研究引起越来越广泛的重视与关注。近年来，Seo等从人牙周膜组织中成功分离出牙周膜干细胞，这类干细胞具有再生牙周组织的能力，体外能够分化为成牙骨质细胞及成骨细胞，在动物体内能够形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨复合结构，因此应用具有高增殖能力、高度自我更新能力、多向分化能力的牙周膜干细胞，将可能构建出工程化的牙周组织，从而实现牙周缺损的再生。因此利用干细胞移植进行再生重建成为治疗牙周疾病的新策略。患有牙周炎的患者口腔内若存在尚未拔除的智齿，可利用其分离出自体牙周膜干细胞，可以为治疗相关疾病提供较丰富的干细胞来源。日本学者Iwata等人通过应用多层牙周膜细胞膜片与PGA膜片复合进行牙周组织再生研究，将复合细胞膜片植入比格犬牙槽骨缺损处，6周后对牙周缺损处检测发现，移植的牙周膜细胞膜片能够促进牙槽骨及牙周膜再生，但是仍需要生物材料作为支架进行牙周组织再生，存在生物材料可能引起机体免疫排斥、材料不能完全降解等问题。综上，目前尚未建立无生物材料工程化牙周组织用于牙周组织再生的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于：提供一种用于牙周组织重建与再生的工程化牙周组织的制备方法。本专利技术之工程化牙周组织的制备方法，系使用牙周膜干细胞，扩增培养后，形成复层化的细胞聚合体；多个牙周膜干细胞细胞聚合体层叠、塑形后形成工程化牙周组织。本专利技术所制备的工程化牙周组织由牙周膜干细胞及其分泌合成的细胞外基质构成，具有制备简便、可塑性强、细胞密度适宜、细胞外基质含量丰富、无需支架材料、体外培养时间短等优点；在体内可形成牙槽骨、牙周膜及牙骨质结构，使得牙周缺损得以恢复。具体步骤包括：步骤一、牙周膜干细胞细胞培养：将智齿的牙周膜组织剪碎，以0.1～0.5g/L的Ⅰ型胶原酶和0.1～0.4g/L的Dispase酶消化0.5～2小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙周膜干细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90%汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞。所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.2～0.4mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。步骤二、牙周膜干细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙周膜干细胞，调整细胞密度为50～200个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80%汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。步骤三、牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为1×105～5×106个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2～3天换液，37℃、5％CO2条件下培养，连续培养1～3周，可在培养皿底部出现乳白色膜样物质，形成牙周膜干细胞聚合体。所述牙周膜干细胞聚合体培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.2～0.4mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5～10ng/mL的转化生长因子-β1、1×10-8～1×10-5M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-5～5×10-4M蛇床子素、1×10-6～5×10-5M脱水淫羊藿素、1×10-5～8×10-4M甘草查尔酮A、50～100μg/mL维生素C、1×10-4～5×10-3M阿司匹林和1×10-7～5×10-5M白藜芦醇。本步骤采用牙周膜干细胞聚合体培养液培养牙周膜干细胞，使牙周膜干细胞改变了常规条件下细胞的接触抑制及密度抑制的性质。在牙周膜干细胞聚合体培养液中，维生素C通过抗氧化加速细胞增殖、促进细胞外基质的合成分泌，阿司匹林维持细胞端粒酶活性，转化生长因子-β1维持细胞快速增殖过程中干细胞干性、白藜芦醇激活细胞Sirt信号抑制细胞衰老，蛇床子素、8-异戊烯基柑橘素、脱水淫羊藿素、甘草查尔酮等中药单体化合物通过激活Smad、p38、MAPK以及Wnt信号通路促进牙髓细胞增殖大量合成、分泌细胞外基质，促进胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等分泌及致密排列，形成复层化结构，并在体外形成含细胞外基质的牙周膜干细胞聚合体，从结构及成分上与天然牙周组织接近。步骤四、工程化牙周组织的制备：将1～5个牙周膜干细胞聚合体重叠后卷成条索状，再使用生物胶固定，然后加入诱导培养液继续培养1～3天，即获得工程化牙周组织。所述诱导培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.292mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5～10ng/mL转化生长因子-β1、1×10-8～1×10-5M的8-异戊烯基柑橘素、1×10-6～5×10-4M甘草查尔酮A、1×10-4～5×10-3M阿司匹林、10～20mMβ-磷酸甘油钠、5～20nM地塞米松和50～100μg/mL维生素C。本步骤将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置，通过诱导培养，使其分化后具有成骨的能力，植入体内后可形成牙槽骨、牙周膜及牙骨质，从而修复牙周缺损。而采用的诱导培养液中，转化生长因子β1能够维持细胞状态及再造体外细胞生长微环境维持干细胞稳定；8-异戊烯基柑橘素、甘草查尔酮A和阿司匹林能分别激活干细胞Smads、BMPs、Wnt信号通路，促进细胞骨向分化；β-磷酸甘油钠、地塞米松和维生素C能够促进细胞骨向分化和钙磷盐的沉积促进生物矿化。本专利技术所制备的工程化牙周组织，其优点体现在：（1）本专利技术之牙周组织，具有和天然牙周组织相似的成分与结构，因此工程化牙周组织植入体内后能够发挥牙周组织的正常功能，可分化出牙周膜细胞及成骨细胞，促进牙周组织再生，最终修复牙周缺损。（2）本专利技术之牙周组织制备方法，使用牙周膜干细胞聚合体的培养技术，使得牙周膜干细胞在体外突破常规培养的限制，形成复层化结构，并大量分泌细胞外基质，作为自体分泌天然支架组装、构建起三维组织结构，保证了植入体内后的信号传导和生长因子的作用微环境。使得制备的工程化牙周组织从结构及成分上与天然牙周组织接近，避免了传统支架材料与局部微环境相容性不佳的缺点。（3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化牙周组织的制备方法，其特征在于：由牙周膜干细胞及其分泌合成的细胞外基质构成，即先将牙周膜干细胞经扩增培养并形成复层化的牙周膜干细胞聚合体，再将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置并塑形，形成工程化牙周组织。

【技术特征摘要】
1.一种工程化牙周组织的制备方法，其特征在于：由牙周膜干细胞及其分泌合成的细胞外基质构成，即先将牙周膜干细胞经扩增培养并形成复层化的牙周膜干细胞聚合体，再将多个牙周膜干细胞聚合体进行层叠放置并塑形，形成工程化牙周组织。2.根据权利要求1所述工程化牙周组织的制备方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞扩增培养步骤和方法是：1)将智齿的组织剪碎，以0.1～0.5g/L的Ⅰ型胶原酶和0.1～0.4g/L的Dispase酶消化0.5～2小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入牙周膜干细胞培养液重悬细胞，置于37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液，细胞培养至90%汇合即可传代，获得第一代牙周膜干细胞；所述牙周膜干细胞培养液的组成为：在商用α-MEM培养液中含有，10%（v/v）胎牛血清、0.2～0.4mg/mL谷氨酰胺、75～125ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；2)牙周膜干细胞筛选：取步骤一得到的第一代牙周膜干细胞，调整细胞密度为50～200个/mL，在37℃、5％CO2条件下培养12小时，隔日换液，待细胞扩增至70～80%汇合后即可传代，得到筛选后的牙周膜干细胞。3.根据权利要求1所述工程化牙周组织的制备方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞聚合体制备：将筛选后的牙周膜干细胞调整细胞密度为1×105～5×106个/mL后接种，加入牙周膜干细胞聚合体培养液，每2～3天换液，37℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇杰，
申请(专利权)人：西安组织工程与再生医学研究所，
类型：发明
国别省市：陕西,61