一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法技术

本发明专利技术公开了一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，细胞外基质的来源为成纤维细胞、成骨细胞等。制备该薄膜主要通过在TiO

A method for obtaining calcium phosphate / extracellular matrix films via a cell slice

The present invention discloses a method for obtaining calcium phosphate / extracellular matrix film through cell slice layer, and the sources of extracellular matrix are fibroblast, osteoblast and so on. The films were prepared mainly by TiO

【技术实现步骤摘要】
一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法
本专利技术涉及组织工程领域，具体涉及一种经由细胞片层获得细胞外基质薄膜的方法。
技术介绍
细胞外基质为宿主细胞提供一切生命活动所必须的物质和信号的支持，它是细胞生长过程分泌的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖以及多种生长因子等组成的复杂网络结构，对细胞的形状、生长、迁移和分化，胚胎的发育以及受损组织或器官的修复等有至关重要的作用。有学者通过机械剥离法获得一层较厚纤维母细胞片层，并通过去细胞化制备得到纤维状的细胞外基质膜，研究发现，所获得的细胞外基质薄膜能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[QiX,QianZ,KannanB,etal.OsteogenicDifferentiationEvaluationofanEngineeredExtracellularMatrixBasedTissueSheetforPotentialPeriosteumReplacement[J].AcsAppliedMaterials&Interfaces,2015,7(41)]。因此，如能在体外获得细胞外基质薄膜具有很强的实际应用意义和研究价值。在体外培养过程中，细胞本身可分泌出细胞外基质并形成包含了细胞外基质及细胞的细胞薄层，但这之后通常的处理方式是酶处理，消化掉细胞外基质使细胞脱离培养表面，无法获得所需的细胞外基质。而如单采用机械剥离方式，其过程中对细胞片层及细胞外基质造成了一定的机械损伤，从而使细胞外基质超微结构发生一定变化，最终影响后续对其它细胞的增殖分化的促进作用。本专利技术在近年来的报道的光致细胞薄层获取技术基础上，开发了一种经由细胞薄层获取细胞外基质薄膜的方法。该方法利用光致细胞薄层脱附技术能够获得具有细胞外基质含量高、活性功能良好的细胞薄层的特点[Y.Hong,M.F.Yu,W.J.Weng,K.Cheng,H.M.Wang,J.Lin.Light-inducedcelldetachmentforcellsheettechnology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，将之通过一系列的处理形成了一种具有高活性的细胞外基质薄膜。该方法获得的细胞外基质薄膜保持了原有的超微结构和组成成分，并具有良好的韧性，可应用于组织工程等领域。这意味薄层中的细胞具有良好的活性。同时，磷酸钙材料也是一种广泛应用于组织修复的材料。有鉴于此，本专利技术开发一种将细胞薄层磷酸钙复合后得到磷酸钙/细胞外基质复合薄膜的方法。本专利技术的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用，所得到的复合薄膜具有良好的生物相容性和组织修复特性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法。制备上述的细胞外基质薄膜的方法，包括如下步骤：(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105～1×106细胞密度将细胞接种于细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每2～3天换液一次，整个培养周期5～10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；(3)通过波长长于350nm的紫外光或可见光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗，用固定剂对细胞片层进行固定，避光处理30～60min；(4)将细胞片层浸泡在0.01～0.06mol/L的氢氧化钙溶液中1～10分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在20～37℃解冻，上述冷冻-解冻循环重复3～10次，之后用PBS缓冲液冲洗，最后用去离子水清洗，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。所述的细胞培养表面为表面涂有TiO2纳米点薄膜的石英玻璃、硅酸盐玻璃、钽金属片、钛金属片或钛镍合金片，或具有P/N结的硅片。细胞外基质的来源为成纤维细胞、成骨细胞等。所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。本专利技术的制备方法具有如下特点：1)采用表面含有TiO2纳米点薄膜的基板进行细胞培养，通过紫外光灯照射，使细胞从基板上脱附下来，减少细胞片层的机械损伤，从而获得完整的细胞片层。2)干燥处理前采用固定剂进行处理，保持了细胞外基质的原有微观结构。本专利技术所涉及的细胞外基质薄膜的制备过程，无论是细胞的体外培养，细胞片层的脱附，还是磷酸钙的复合，都是比较简洁易行的，对设备没有过高的要求。本专利技术的细胞外基质薄膜，保持了原有的结构形貌，具有良好的生物相容性，为培养同种或异种细胞提供了有利的微环境，有利于细胞的粘附、增值，对细胞的分化也产生影响，可应用于组织工程等领域。此外本专利技术的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。附图说明图1是实例1制得的磷酸钙/细胞外基质薄膜的表面形貌图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1(1)对表面涂有TiO2的石英玻璃进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105细胞密度将细胞接种于细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；(3)通过波长长于350nm的紫外光光照5min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗2遍，用甲醛对细胞片层进行固定，避光处理30min；(4)将细胞片层浸泡在0.01mol/L的氢氧化钙溶液中1分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在20℃解冻。冷冻-解冻循环重复3次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。本例制得的磷酸钙/细胞外基质薄膜的表面形貌图如图1所示，可以看出薄膜存在一定的孔状结构。实施例2(1)对表面涂有TiO2的硅酸盐玻璃进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心3min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以3×105细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期9天，最终在基板上形成完整的细胞片层；(3)通过波长长于350nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗2遍，用多聚甲醛对细胞片层进行固定，避光处理35min；(4)将细胞片层浸泡在0.02mol/L的氢氧化钙溶液中3分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在23℃解冻。冷冻-解冻循环重复4次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。实施例3(1)对表面涂有TiO2的钽金属片进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用DM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×10

【技术特征摘要】
1.一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105～1×106细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每2～3天换液一次，整个培养周期5～10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；(3)通过波长长于350nm的紫外光或可见光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗，用固定剂对细胞片层...

【专利技术属性】
技术研发人员：程逵，周贝贝，陈樽，翁文剑，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33