蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜及其制备方法。所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。本发明专利技术所用的蓝鲨鱼皮胶原和壳聚糖均为天然可降解材料，具有优异的生物相容性，且来源广泛。本发明专利技术所采用的静电纺丝方法制得的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜，能够很好的模拟天然细胞质基质的结构和功能。这种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜用于牙周组织缺损的治疗，可有效的促进细胞的粘附、增殖和分化，促进牙周组织的引导再生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于新型组织修复生物材料的加工领域，具体涉及蓝鲨鱼皮胶原的制备及蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备。
技术介绍
人体健康容易受到各类疾病的威胁，而口腔疾病是其中的一类多发疾病。人的口腔由于手术和各种常见口腔疾病，极易造成口腔创伤和组织缺损，牙周病就是其中的一种。牙周病是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，它作为常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。因此，牙周病的治疗一直是临床重点研究领域。目前，牙周组织引导再生技术(GTR)是当今先进的牙周治疗方法，牙周组织引导再生技术是利用一种组织引导再生膜放置于牙根和牙龈组织瓣之间，以达到物理性阻挡牙龈结缔组织细胞和上皮组织细胞与牙根先接触，保证由根方残余的牙周膜组织来源细胞和牙槽骨细胞优先占据根面并在其上伸长和向冠方爬行。目前，这种类型的膜材料主要包括不可降解材料和可降解材料两大类，不可降解材料由于不能被组织吸收，需要二次手术取出，增加了病人的痛苦。而可降解材料一般是自体或异体取材，取部分人体组织作为修复材料，移植到有缺损的口腔组织或创面上，但存在来源受限，增加手术风险，免疫原性等问题。因此，开发一种来源广泛的可降解牙周组织引导再生膜对于这类疾病的治疗具有重要意义，而目前市场上的牙周组织引导再生膜材料在设计和性能上均存在各种不足。胶原蛋白主要可分为陆生胶原和水生胶原两种，大部分的陆生和水生胶原都属于I型胶原，胶原由于其结构组成，具有优良的细胞相容性、血液相容性，无免疫原性，可生物降解，能够促进细胞的增殖分化，促进组织再生。目前经常使用的胶原多为陆生胶原，提取自牛、猪等陆生哺乳动物的肌腱、皮、骨等部位，但是由于哺乳动物的传染病等因素，安全性受到威胁，部分国家已经开始限制陆生胶原的使用。而随着海洋资源的开发及工业化加工技术的发展，鱼皮资源日益丰富，从鱼皮中提取安全卫生的胶原蛋白逐渐受到广泛关注。这其中，蓝鲨鱼皮胶原与陆生胶原相比，具有很多的特异性优势，包括优异的细胞相容性和血液相容性，降解产物易被人体吸收利用，促进细胞的生长。到目前为止，国内外的研究者报道了多种胶原蛋白的提取方法。总的来说，依据提取介质的不同，鱼类胶原蛋白的提取方法可分为五类：热水法、碱法、酸法、盐法以及酶法。不论哪种方法，其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质或基质中分离出来。在很多情况下，单一的提取方法达不到预期目标，有很多缺点，不利于实际的工业化生产。例如：热水提取法：由于提取温度较高，胶原蛋白易于变性；碱提取法：提取速度快而且彻底，胶原蛋白的结构变异；酸提取法：可以最大程度地保持其三股螺旋结构，但产品得率较低、溶剂残留、提取时间较长、步骤繁琐，而且提取后的废液排放对环境会造成一定影响；盐析法：提取所得的胶原蛋白需透析去除盐份，工艺繁杂，得率较低；酶提取法：提取的溶出率高并且能降低胶原的抗原性，但水解不够彻底、成本较高，可能会引起胶原蛋白结构部分发生变化，易获得小分子肽，影响纯化产品的品质。本工艺采用新型的等电点提取法，可以高效简便的获得高纯度、大分子鱼皮胶原蛋白，便于工业化大规模生产。壳聚糖是自然界中存在的天然碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰基产物，甲壳素在自然界中含量仅次于纤维素，来源广泛。壳聚糖作为一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性、无毒、对粘膜无刺激性，可以促进黏膜粘附，在生物医用材料领域具有广泛的应用。静电纺丝技术是目前制备纳米纤维最简单有效的方法，在静电纺丝过程中，纺丝溶液置于针管当中，被微量推进控制装置推出至针头，在高压电场的作用下，纺丝溶液从针头喷出，经过电场的拉伸，溶剂挥发形成纤维，最后被收集在接地的收集装置上。不同的收集装置可以制备出不同类型的试样。采用平板接收装置可以制备出具有小孔径、高孔隙率的纳米纤维膜。通过静电纺丝制备的纳米纤维膜可以模拟细胞外基质的结构功能，有利于细胞的粘附、增殖和分化。公开号CN1562388A公开了一种口腔组织补片，由人的异体或哺乳动物的膜状或片状组织经脱细胞处理而成的具有三维空间框架结构的细胞外基质。该种方法制备的组织补片材料由于脱除了抗原细胞，有效解决了异体排异问题。但该种方法存在取材复杂、来源受限，且存在哺乳动物的传染病等安全性威胁。公开号CN101791431A公开了一种以人工合成聚酯类聚合物或天然生物可降解高分子材料为原料，通过静电纺丝工艺制备了负载有生长因子的纳米结构薄膜材料，具有抑制炎症和促进组织再生的优势，但人工合成材料的降解产物会对组织的生长产生不良影响。技术专利授权号CN205073351U公开了一种口腔补片，以脱细胞质基质作为基底层，通过物理吸附或蛋白胶粘合的方式固定一层蛋白质疏松层。该种方法制备的口腔补片具有组织相容性好，可逐步降解和厚度适宜等优点，但材料的柔顺性和贴合性较差，难以在复杂创面情况下进行有效贴合。公开号CN1107742A公开了一种组织引导再生胶原膜，通过酶消化法从哺乳动物结缔组织中提取胶原，再经冷冻干燥法成型。这种材料可降解吸收，不需要二次手术取出，具有良好的理化性能和生物相容性。公开号CN103191085A提供了一种双层复合再生膜的制备方法，由可降解高分子纤维网与冻干胶原膜复合而成，冻干胶原膜中复合有纳米银离子和抗生素药物。用于组织修复可促进伤口的愈合，提高引导膜的机械强度。公开号CN103071189A公开了将胶原经过溶解、离心、冻干、交联后制备成组织引导再生用胶原膜的方法。该方法具有工艺简单、成本低的优点，且制备的胶原膜具有良好的力学性能。公开号CN105079877A公开了将丝素蛋白经过冷冻干燥和氨基酸交联增塑制备牙周补片的方法，该种方法制备的牙周补片具有良好的柔韧性和机械强度，且制备工艺简单，适于规模化生产。以上专利采用冷冻干燥的方法制备组织引导再生材料虽然具有良好的生物相容性和机械性能，但都不能很好的模仿细胞外基质的结构和功能，且由于孔径较大，难以起到细胞屏蔽和引导细胞贴壁生长的作用。目前关于对牙周组织引导再生膜材料的研究当中，以自体或异体的脱细胞质基质和各种可降解材料的冻干膜为主。使用脱细胞质基质制备组织引导再生材料会存在材料来源受限，取材和制备过程繁琐，容易受到哺乳动物的传染病及各种病毒性疾病的威胁。用天然材料如胶原等的冻干膜制备的组织引导再生材料由于孔径较大、孔的连通性差等问题，难以较好的模拟细胞质基质的结构功能，不利于细胞的粘附生长和组织间营养物质的运输。除了天然材料，使用合成可降解材料时会存在降解产物的炎症反应等问题。因此，在开发牙周组织引导再生材料时，除了要使用具有优良生物相容性的天然可降解材料之外，还应该要尽可能的模拟细胞质基质的结构和功能，以达到最佳的引导组织再生效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有材料和制备技术的不足，提出一种蓝鲨鱼皮胶原的制备提纯方法，并以制备的蓝鲨鱼皮胶原为原料复合壳聚糖、PEO其中的一种或多种制备具有仿细胞质基质的结构和功能的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。

【技术特征摘要】
1.一种蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：制备蓝鲨鱼皮胶原，利用蓝鲨鱼皮胶原或蓝鲨鱼皮胶原以及壳聚糖和PEO中的至少一种进行静电纺丝，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜。2.如权利要求1所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的蓝鲨鱼皮胶原的制备方法包括：第一步：去除蓝鲨皮下肌肉和脂肪组织，在蒸馏水下清洗浸泡0.5-1h，将鱼皮剪成直径3-5mm碎片，过滤备用；第二步：将鱼皮置于0.25-0.5mol/LNaOH溶液中脱脂处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏8-16h，取出后用蒸馏水清洗过滤；第三步：将鱼皮置于70％-90％的乙醇溶液中进行脱糖处理，用磁力搅拌器搅拌2-6h，取出后用蒸馏水清洗过滤；第四步：将鱼皮用粉碎机粉碎，置于0.25-0.5mol/L冰醋酸溶液中水解处理，用磁力搅拌器搅拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏2-8h，得到提取物；第五步：采用等电点技术，将上述提取物，先经过纱网过滤，取滤液，在滤液中滴加0.25-0.5mol/LNaOH溶液至等电点时，可见白色棉絮状物析出，将其过滤取沉淀物，蒸馏水清洗后挤干封装，冷冻干燥保存，即为蓝鲨鱼皮胶原。3.如权利要求2所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，经过SDS-PAGE凝胶电泳检测所得的蓝鲨鱼皮胶原为I型胶原，相对分子量为100-300KDa。4.如权利要求1所述的蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，利用蓝鲨鱼皮胶原进行静电纺丝的具体步骤包括：步骤A：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇10-90vol％和余量的乙酸的混合溶液；步骤B：在纺丝电压为4-30KV，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中干燥后，得到蓝鲨鱼皮胶原牙周组织引导再生纳米纤维膜；所述的利用蓝鲨鱼皮胶原以及PEO进行静电纺丝的具体步骤包括：步骤a：在溶剂中加入蓝鲨鱼皮胶原，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解后加入PEO，再次搅拌至完全溶解，得到纺丝液，所述溶剂为六氟异丙醇0-90vol％、去离子水0-60vo1％和余量的乙酸的混合溶液；步骤b：在纺丝电压为4-30Kv，纺丝液给进速率为0.5-1.5ml/h、接收距离为10-30cm、环境温度为15-40℃、相对湿度为10-60％的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，蒋升，赵新哲，李选，徐晓刚，李铁军，繆辉南，王富军，高晶，
申请(专利权)人：东华大学，中国人民解放军第二军医大学，上海长海医院，
类型：发明
国别省市：上海;31