非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法技术

本发明专利技术公开了一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，属于基因检测领域。本发明专利技术基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明专利技术的检测方法灵敏度高，检测灵敏度高达0.01％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测领域，更具体地说，涉及一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法。
技术介绍
全国第三次人口死亡病因调查显示，过去三十年来，我国肺癌的死亡率上升了465％，超过肝癌成为死亡率最高的癌症。据估计，2015年我国肺癌的新发病例为733300例(男性509300例、女性224000例)，死亡610200例(男性432400例、女性177800例)，其发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的首位。因此，肺癌在我国已成为一个非常重要的公共卫生问题。肺癌根据组织学可分为小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％左右，主要分为腺癌(～50％)和鳞癌(～40％)两个亚型。通常腺癌发生在肺段支气管以下的细支气管或肺泡壁。鳞癌则多发生在肺中央的主支气管和支气管的管腔并伴随着慢性炎症。目前，临床上非小细胞肺癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据，使用的治疗方法是根据其分期采取手术或手术结合放化疗进行治疗。但由于非小细胞肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70％以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而非小细胞肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30％左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化疗后很快耐药，从而导致非小细胞肺癌患者确诊后5年生存率很低，晚期患者五年生存期只有15％左右。近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注并广泛应用于临床。分子靶向治疗是使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更小和特异性更高，也为晚期非小细胞肺癌患者提供了新的有效治疗手段。这其中最典型的例子是肺腺癌的EGFR突变靶向治疗。在我国，约30％非小细胞肺癌患者存在EGFR突变。对这类患者采用EGFR激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，有效率可以达到70％～80％。过去十年针对非小细胞肺癌的特定基因突变开展的靶向治疗就已让晚期肺癌患者中位生存期显著增加2.4倍，从此前的14.1个月延长至33.5个月，相较于传统的治疗方法优势明显。目前，临床上关于非小细胞肺癌的靶向药物，然而除激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼以外，还有作用于AKT的抑制剂普喹替尼和MK-2206 2HCL等，ALK突变靶向药物克唑替尼、色瑞替尼、Crizotinib、Ceritinib、氟卓替尼、Ganetespib和PF-06463922等，可靶向作用于BRAF突变的维罗非尼、索拉菲尼、曲美替尼、达拉替尼极易西妥昔单抗和帕尼单抗等，作用于EGFR突变的还有埃克替尼、AZD9291、艾力替尼、西帕替尼、易吡替尼、西莫替尼、席栗替尼、吡咯替尼、麦他替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、Hemay020、Rociletinib、HM61713、WZ4002和AZD3759等，ERBB抑制剂达可替尼、Neratibib、Tovok-afatinib-BIBW2992和PF-00299804等，FGFR1/2/3抑制剂Nintedanib、索凡替尼、德立替尼、丙氨酸布立尼布、AZD4547等，KRAS的抑制剂瑞格菲尼、Deltarasin及西妥昔单抗，抑制MET的小分子化合物Ficlatuzumab、INC280、赛尔非尼、沃利替尼、宁格替尼、Tivantinib、Foretinib和Golvatinib等，可靶向作用于PIK3CA突变的吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗和尼妥珠单抗等，作用于PTEN突变的西妥昔单抗和尼妥珠单抗等。然而，并非所有的非小细胞肺癌患者对分子靶向治疗均表现出较好的疗效，比如现有资料表明EGFR基因突变与EGFR激酶抑制剂敏感性相关，EGFR基因突变患者对EGFR激酶抑制剂吉非替尼的有效率达60％以上，而EGFR基因野生型(即未突变型)患者的有效率仅为10％－15％。因此，明确肺癌组织的突变状况对靶向药物的临床使用和疗效预测有重要的指导意义。而分子靶向药物的使用需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变，所以基因突变的检测是确定治疗方案的关键。临床中非小细胞肺癌的诊断样品70％是小的活检样品，其首先被用于临床病理学诊断，剩下的有限组织若要用作分子诊断，则对其核酸含量及提取方法都有较高的技术操作要求。且病理形态相同的非小细胞肺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异质，这种组织的异质性使得一些活检样本无法反应肿瘤基因突变的全貌，从而导致对靶向治疗的反应差别很大。同时，肿瘤异质性也是不断变化的，无法通过一两次的活检或组织样本来检测患者的病情。高通量测序技术是一项国际先进的新型测序技术，它通过多基因、多位点的集成式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。它所需的核酸要求不高，是应用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测难以满足指导个体化治疗的需要。而以高通量测序和大数据分析为基础，对非小细胞肺癌进行多基因突变检测，能够精确的地给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于非小细胞肺癌病人的早期诊断和筛查。目前，市场上对于非小细胞肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等方法，例如，中国专利申请号为201310200169.7，申请公布日为2013年9月11日的专利文件公开了一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试剂盒，包括以下序列：SEQ ID NO1-SEQ ID NO12，该专利技术的引物和探针可以特异检测ALK基因表达差异，以确定是否存在ALK基因融合，该专利技术建立的用于检测ALK基因表达差异的实时荧光PCR体系，通过检测5’端和3’端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的定性评估，适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。中国专利申请号为201310068052.8，申请公布日为2013年6月5日的专利文件公开了一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。该专利技术针对非小细胞肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680，rs16969968，rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为非小细胞肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。然而，由于癌症是基因组疾病，单一或几个基因突变位点的检测难以满足指导个体化治疗的需要。已经报道的几种检测非小细胞肺癌的方法只包含了极少的几个基因突变位点，不能有效的反应患者癌症突变的全貌，难以用于临床指导，且临床发现单一基因的靶向用药多数存在治疗无效或很快产生药物抗性等不利反应，因此，我们需要一种更加全面有效的检测手段。同时，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，且由于我们对绝大多数基因突变在癌症中的功能认识有限，目前仅针对极少的一部分基因研发出了靶向药物。因此，全基因组或全外显子测序检测肺癌的方法无法应用于临床需求。根据前期研究表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其步骤包括：A.从待测样品中提取基因组DNA；B.使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库；D.对步骤C中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息。

【技术特征摘要】
1.一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其步骤包括：A.从待测样品中提取基因组DNA；B.使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库；D.对步骤C中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息。2.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：检测的基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN。3.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒、石蜡包埋组织DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒、血清DNA提取试剂盒或血浆基因组DNA提取试剂盒。4.根据权利要求3所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0；步骤B中的特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96进行多重PCR扩增时同时加入。5.根据权利要求4所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：5X PCR Buffer 10μL、25mM的MgCl2 3μL、10mM的dNTPs 2μL、100nM的Primers Mix 10μL、DNA template 10～20ng、5U...

【专利技术属性】
技术研发人员：林文楚，王伟，洪波，李红，高小平，王伙刚，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34