【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫细胞治疗(adoptive cellular immunotherapies，acis)领域，更为具体的，本专利技术涉及一种双靶点嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)修饰的t细胞、其构建方法及应用。
技术介绍
1、肿瘤的异质性(恶性肿瘤的特征之一，即肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。其中影响car-t细胞治疗的重要表征为肿瘤特异性抗原在不同肿瘤细胞表面呈现差异化表达)，肿瘤细胞表面肿瘤特异抗原的表达缺失或低表达等因素都会导致常规的单靶点嵌合抗原受体介导的car-t细胞治疗技术的效果不理想，甚至完全不能缓解病情，以及治疗后易复发。
2、克服抗原丢失导致的复发、提高疗效和安全性是car-t细胞治疗优化的主要方向(wang et al.,2017)。肿瘤细胞通过几种不同的方式逃避car-t细胞的识别和杀伤：(1)通过表达缺乏car-t细胞识别的细胞外表位的替代形式的靶抗原(抗原逃逸)；(2)通过切换到遗传相关但表型不同的疾病(谱系转换)；(3)通过下调肿瘤表面靶抗原的表达(抗原下调)(majzner and mackall,2018)。肿瘤细胞的异质性是抗肿瘤治疗的另一个关键挑战。尽管肿瘤微环境通过生长资源限制、免疫细胞浸润以及组织缺氧、酸中毒等多种方式限制癌细胞增殖，肿瘤细胞依然具备适应环境且发挥对自身有利因素的能力，以应对肿瘤微环境的不利影响(mcgr
3、然而现有的双靶点car-t方案，多为串联表达两个scfv(single-chain fragmentvariable)于单个car-t载体上(如图1所示)，这种结构具有以下缺陷：(1)串联scfv在折叠过程中可能会发生构象改变，丧失与肿瘤靶抗原结合的能力；(2)两个scfv的抗原结合表面不能充分暴露，并与肿瘤靶抗原的抗原决定簇结合。这些缺陷甚至会影响到每种scfv的功能，使其效果尚不及单scfv的car-t。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体及其表达载体，以实现对单靶抗原靶点丢失复发和治疗后缓解期短的患者的治疗。用该表达载体与慢病毒辅助包装质粒同时转染宿主细胞，得到含有car基因的重组慢病毒。用该慢病毒制剂转染cd3+t细胞，筛选膜表面同时表达针对两种靶抗原的嵌合抗原受体序列的阳性car-t细胞，用于治疗血液肿瘤、实体肿瘤及艾滋病。该专利技术提供的双靶点car-t细胞，既能识别同时表达两种靶抗原的靶细胞，又能识别只表达一种靶抗原的靶细胞，可解决单靶点car-t细胞治疗后缓解期短、易复发的难题。为了实现上述技术效果，本专利技术具体提供如下的技术方案：
2、本专利技术的第一个方面，提供一种联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体(car)，该car结构包含第一car分子和第二car分子，其中，第一car分子包含信号肽(signalpeptide,sp)、单链抗体可变区(scfv)、cd8α铰链区(cd8αhinge)、跨膜区(transmembrane,tm)和cd3激活结构域，第二car分子包含信号肽(signal peptide,sp)、单链抗体可变区(scfv)、cd8α铰链区(cd8αhinge)、跨膜区(transmembrane,tm)和共刺激结构域，并且，第二car分子不含有cd3激活结构域；第一car分子和第二car分子通过p2a自剪切序列拼接。
3、在一种实施方式中，所述信号肽为任意的可指导与之连接的蛋白序列穿膜转移至t细胞膜外的信号肽序列。如cd8信号肽、ef-1α启动子、cd28信号肽、gm-csf信号肽、cd4信号肽或cd137信号肽等。
4、在一种实施方式中，所述共刺激结构域为cd28或4-1bb。
5、在一种优选的实施方式中，所述cd3激活结构域中只保留距离细胞膜最近的itam活性或只保留itam1。
6、在一种优选的实施方式中，将第一car分子和第二car分子cd8α区中构成链间二硫键的两个半胱氨酸位点进行突变，从而消除第一car分子和第二car分子在胞外区的相互作用；同时，将在第一car分子和第二car分子的跨膜区之后插入g4s-c-c-g4s序列，形成胞内二硫键。
7、在一种优选的实施方式中，所述两个半胱氨酸位点的突变为c164s和c181s。
8、在一种实施方式中，第一car分子和第二car分子中的scfv均可由高亲和力纳米抗体的重链可变区(vhh)替代。
9、本专利技术的第二个方面，提供一种包含上述双特异性car的表达载体。
10、本专利技术的第三个方面，提供一种包含上述双特异性car的重组慢病毒，其制备方法包括将上述双特异性car的表达载体与辅助质粒共转染293t细胞，收取上清液并离心。
11、本专利技术的第四个方面，提供上述双特异性car基因修饰的cd3+t细胞。
12、本专利技术的第五个方面，提供一种上述双特异性car、联合表达载体、重组慢病毒或双特异性car基因修饰的cd3+t细胞用于制备治疗或预防肿瘤相关疾病的药物中的应用。
13、在一种实施方式中，所述疾病是指由于某单一靶抗原丢失引起的复发/难治性肿瘤或艾滋病。
14、本专利技术相对于现有技术，获得了如下显著的技术效果：
15、本专利技术所包含的基因构建策略，将两个scfv分别独立地表达于细胞膜表面，各成一个独立的car分子，能解决如下三个技术难题：
16、(1)针对双靶抗原的car-t构建能很大程度提高对异质性或单靶点缺失的肿瘤细胞/艾滋病靶细胞的杀伤效率。
17、(2)串联scfv在折叠过程中可能会发生构象改变，丧失与靶抗原结合的能力；而本专利技术设计的重组car中两个scfv各自独立折叠，相互不干扰。表达在t细胞膜上的car分子，各自均能发挥最优的识别靶抗原功能。
18、(3)两个car分子通过紧邻跨膜区的胞内二硫键发生二聚化共享cd3ζ和4-1bb，大大降低了t细胞过量激活引起的耗竭，保证了car-t细胞在体内持续发挥杀伤靶细胞的作用，延长了作用时效。
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1.一种联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述双特异性CAR包含第一CAR分子和第二CAR分子，其中，第一CAR分子包含信号肽(signal peptide,SP)、单链抗体可变区(scFv)、CD8α铰链区(CD8αhinge)、跨膜区(transmembrane,TM)和CD3激活结构域，第二CAR分子包含信号肽(signal peptide,SP)、单链抗体可变区(scFv)、CD8α铰链区(CD8αhinge)、跨膜区(transmembrane,TM)和共刺激结构域，并且，第二CAR分子不含有CD3激活结构域；第一CAR分子和第二CAR分子通过P2A自剪切序列拼接。
2.如权利要求1所述的双特异性CAR，其特征在于，所述共刺激结构域为CD28或4-1BB。
3.如权利要求1或2所述的双特异性CAR，其特征在于，所述CD3激活结构域中只保留距离细胞膜最近的ITAM活性或只保留ITAM1。
4.如权利要求3所述的双特异性CAR，其特征在于，将第一CAR分子和第二CAR分子CD8α区中构成链间二硫键的两个半胱氨酸
5.如权利要求4所述的双特异性CAR，其特征在于，所述两个半胱氨酸位点的突变为C164S和C181S。
6.如权利要求5所述的双特异性CAR，其特征在于，第一CAR分子和第二CAR分子中的scFv均可由高亲和力纳米抗体的重链可变区(VHH)替代。
7.一种联合表达两种单链抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1-6任一所述的双特异性CAR。
8.一种重组慢病毒，其特征在于，其制备方法包括：将如权利要求7所述的联合表达两种单链抗体的表达载体与辅助质粒共转染293T细胞，收取上清液并离心。
9.一种双特异性CAR基因修饰的CD3+T细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求8所述的重组慢病毒感染CD3+T细胞获得。
10.一种如权利要求1-6任一所述的双特异性CAR、如权利要求7所述的联合表达两种单链抗体的表达载体、如权利要求8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的双特异性CAR基因修饰的CD3+T细胞在用于制备治疗或预防肿瘤或艾滋病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述双特异性car包含第一car分子和第二car分子，其中，第一car分子包含信号肽(signal peptide,sp)、单链抗体可变区(scfv)、cd8α铰链区(cd8αhinge)、跨膜区(transmembrane,tm)和cd3激活结构域，第二car分子包含信号肽(signal peptide,sp)、单链抗体可变区(scfv)、cd8α铰链区(cd8αhinge)、跨膜区(transmembrane,tm)和共刺激结构域，并且，第二car分子不含有cd3激活结构域；第一car分子和第二car分子通过p2a自剪切序列拼接。
2.如权利要求1所述的双特异性car，其特征在于，所述共刺激结构域为cd28或4-1bb。
3.如权利要求1或2所述的双特异性car，其特征在于，所述cd3激活结构域中只保留距离细胞膜最近的itam活性或只保留itam1。
4.如权利要求3所述的双特异性car，其特征在于，将第一car分子和第二car分子cd8α区中构成链间二硫键的两个半胱氨酸位点进行突变，从而消除第一car分子和第二car分子在胞外区...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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