一种基于CRISPR技术检测目标突变的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变的方法，其特征在于，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与突变型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，所述目标突变设置于gRNA导向序列从5

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测目标突变的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及利用CRISPR技术检测目标突变，尤其涉及检测靶核酸是否存在目标突变和检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,single nucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。
[0003]目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。
[0004]本专利技术将CRISPR的核酸检测技术应用到检测靶核酸在目标区域是否存在突变和检测靶核酸是否存在目标突变中，具体的，提供给了高效的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变位点和检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法、系统和试剂盒。
[0006]检测目标突变的方法
[0007]一方面，本专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变位点的方法，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列，所述导向序列包括与所述目标突变位点配对的碱基；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号。
[0008]一种实施方式中，所述目标突变是野生型靶核酸与突变型靶核酸在gRNA导向序列所靶向区域内不一致的位点；由于gRNA的导向序列与突变型靶核酸杂交、包括与所述目标突变位点配对的碱基，此时，所述目标突变位点也是指gRNA导向序列与其所靶向的野生型
靶核酸序列不一致的位点。
[0009]所述目标突变可以是单碱基突变、两个碱基突变、三个碱基突变或四个碱基突变；可以是连续的单碱基突变，也可以是不连续的单碱基突变。
[0010]在一个实施方式中，所述目标突变是单碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第10位、第11位、第12位和第13位中的的任一个；
[0011]在其他的实施方式中，所述目标突变可以是两个碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第10位和第11位、第10位和第12位、第10位和第13位、第11位和第12位、第11位和第13位、第12位和第13位中的任意一种。
[0012]在其他的实施方式中，所述目标突变可以是三个碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第10位和第11位和第12位、第11位和第12位和第13位、第10位和第11位和第13位、第10位和第12位和第13位中的任意一种。
[0013]在其他的实施方式中，所述目标突变可以是四个碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第10位、第11位、第12位和第13位。
[0014]进一步的，所述gRNA导向序列在非与所述目标突变位点配对的碱基处设置有突变的碱基，所述突变的碱基为与所述靶核酸相应位置不能杂交的碱基，所述突变的碱基的位置位于所述gRNA导向序列的非5
’
端第10位
‑
13位。
[0015]优选的，突变的碱基的位置位于所述gRNA导向序列的5
’
端第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第14位、第15位或第16位，更优选，5
’
端第1位、第2位、第6位、第7位、第8位或第9位。
[0016]在一种实施方式中，上述gRNA导向序列在非与所述目标突变位点配对的碱基处设置有突变的碱基可以提高检测的效率，所述效率包括准确度、灵敏度。
[0017]上述方法中检测突变型靶核酸的可检测信号强度与检测野生型靶核酸时的信号明显不同；具体而言，检测突变型靶核酸的可检测信号明显强于检测野生型靶核酸时的信号，此时，可以根据可检测信号的强弱确定靶核酸中是否存在目标突变位点。
[0018]在一种实施方式中，野生型靶核酸的可检测信号与突变型靶核酸的可检测信号可以是不同的可检测信号，野生型靶核酸的可检测信号与突变型靶核酸的可检测信号也可以是相同的可检测信号。
[0019]优选的，所述方法中还包括检测野生型靶核酸进行对照的步骤，所述方法中还包括提供标准野生型靶核酸的步骤。
[0020]优选的，所述方法中还包括检测突变型靶核酸进行对照的步骤，所述方法中还包括提供标准突变型靶核酸的步骤。
[0021]在其他的实施方式中，本专利技术还提供了上述V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器在制备用于检测靶核酸是否存在目标突变位点的试剂、组合物或试剂盒中的用途。
[0022]在一种实施方式中，所述gRNA中与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域设置在与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列的5'端。
[0023]在优选的实施方式中，上述目标突变位点为SNP。
[0024]检测目标区域是否存在突变的方法
[0025]一方面，本专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸在目标区域是否存在突变
的方法，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与野生型型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列，所述导向序列包括与所述目标突变位点配对的碱基；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号；与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第10位、第11位、第12位和第13位中的一个或多个位置。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA导向序列在非与所述目标突变位点配对的碱基处设置有突变的碱基，所述突变的碱基为与所述靶核酸相应位置不能杂交的碱基，所述突变的碱基的位置位于所述gRNA导向序列的5
’
端非第10位
‑
13位；优选的，所述突变的碱基的位置位于所述gRNA导向序列的5
’
端第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第14位、第15位或第16位，更优选，5
’
端第1位、第2位、第6位、第7位、第8位或第9位。3.一种基于CRISPR技术检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法，其特征在于，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与野生型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，所述目标区域是指gRNA导向序列5
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端第10位
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第13位所靶向的靶核酸的位置。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA导向序列在5
’
端非第10位
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13位的碱基处设置有突变的碱基，所述突变的碱基为与所述靶核酸相应位置不能杂交的碱基；优选的，所述突变的碱基的位置位于所述gRNA导向序列的5
’
端第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第14位、第15位或第16位，更优选，5
’
端第1位、第2位、第6位、第7位、第8位或第9位。5.如权利要求1
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4任一所述的方法，其特征在于，所述V型CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，段志强，孙洁，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：