利用Cas12j效应蛋白检测目标突变的方法技术

本发明专利技术提供了利用Cas12j效应蛋白检测目标突变的方法。所述方法为一种利用Cas12j效应蛋白检测靶核酸是否存在目标突变的方法，包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与突变型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，所述目标突变设置于gRNA导向序列从5

【技术实现步骤摘要】
利用Cas12j效应蛋白检测目标突变的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，涉及利用CRISPR技术检测目标突变，尤其利用Cas12j效应蛋白检测目标突变的方法。

技术介绍

[0002]特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,single nucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。
[0003]目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。
[0004]本专利技术将CRISPR的核酸检测技术应用到检测靶核酸在目标区域是否存在突变和检测靶核酸是否存在目标突变中，具体的，提供给了高效的检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种利用Cas12j效应蛋白检测靶核酸中是否存在目标突变位点和检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法、系统和试剂盒。
[0006]检测目标突变的方法
[0007]一方面，本专利技术提供了一种利用Cas12j效应蛋白检测靶核酸是否存在目标突变位点的方法，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列，所述导向序列包括与所述目标突变位点配对的碱基；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号。
[0008]在一个实施方式中，所述目标突变是野生型靶核酸与突变型靶核酸在gRNA导向序列所靶向区域内不一致的位点；由于gRNA的导向序列与突变型靶核酸杂交、包括与所述目标突变位点配对的碱基，此时，所述目标突变位点也是指gRNA导向序列与其所靶向的野生
型靶核酸序列不一致的位点。
[0009]在一个实施方式中，所述gRNA的导向序列包含至少13个碱基，例如，13
‑
30个碱基，例如，14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基。
[0010]在一个实施方式中，所述目标突变包括单碱基突变、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个碱基突变或更多的碱基突变；所述目标突变可以是连续的碱基突变，也可以是不连续的碱基突变；优选的，所述目标突变包括单碱基突变或两个碱基突变，优选的，所述两个碱基突变是连续的两个碱基发生突变。
[0011]在一个实施方式中，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第1
‑
20位中的一个或多个，具体的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位中的一个或多个；优选的，5
’
端第7
‑
16位中的一个或多个，更优选的，5
’
端第9位和/或第10位。
[0012]在一个实施方式中，所述目标突变是单碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第1
‑
20位，具体的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位；优选的，5
’
端第7
‑
16位，更优选的，5
’
端第9位或第10位；
[0013]上述方法中检测突变型靶核酸的可检测信号强度与检测野生型靶核酸时的信号明显不同；具体而言，检测突变型靶核酸的可检测信号明显强于检测野生型靶核酸时的信号，此时，可以根据可检测信号的强弱确定靶核酸中是否存在目标突变位点。
[0014]在一种实施方式中，野生型靶核酸的可检测信号与突变型靶核酸的可检测信号可以是不同的可检测信号，野生型靶核酸的可检测信号与突变型靶核酸的可检测信号也可以是相同的可检测信号。
[0015]优选的，所述方法中还包括检测野生型靶核酸进行对照的步骤，所述方法中还包括提供标准野生型靶核酸的步骤。
[0016]优选的，所述方法中还包括检测突变型靶核酸进行对照的步骤，所述方法中还包括提供标准突变型靶核酸的步骤。
[0017]在一种实施方式中，本专利技术还提供了上述V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器在制备用于检测靶核酸是否存在目标突变位点的试剂、组合物或试剂盒中的用途。
[0018]在一种实施方式中，上述目标突变位点包括取代(替换)、插入或缺失，优选的。所述突变为点突变。
[0019]在一种实施方式中，靶核酸是经过扩增方法确认过靶核酸中存在目标突变位点上游(5
‘
端)500bp
‑
下游(3
‘
端)500bp的片段，优选的，目标突变位点上游(5
‘
端)300bp
‑
下游(3
‘
端)300bp的片段，目标突变位点上游(5
‘
端)200bp
‑
下游(3
‘
端)200bp的片段，更优选的，目标突变位点上游(5
‘
端)100bp
‑
下游(3
‘
端)100bp的片段，所述扩增方法包括PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等常见的扩增方法，优选的是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用Cas12j效应蛋白检测靶核酸中是否存在目标突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列，所述导向序列包括与所述目标突变位点配对的碱基；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号；与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第1位
‑
第20位中的一个或多个位置；优选的，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第7位
‑
第16位中的一个或多个位置；更优选的，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5
’
端第9位
‑
第10位中的一个或多个位置。2.一种利用Cas12j效应蛋白检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与野生型型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号；所述目标区域是指gRNA导向序列5
’
端第1位
‑
第20位所靶向的靶核酸的位置；优选的，所述目标区域是指gRNA导向序列5
’
端第7位
‑
第16位所靶向的靶核酸的位置；更优选的，所述目标区域是指gRNA导向序列5
’
端第9位
‑
第10位所靶向的靶核酸的位置。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。4.根据权利要求1
‑
3所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸；优选的，包括单链核酸、双链核酸，例如，单链DNA、双链DNA、单链RNA。5.如权利要求1
‑
4所述的方法，其特征在于，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白为Cas12j蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：