一种检测低比例嵌合变异的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测低比例嵌合变异的方法，包括以下步骤：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。本发明专利技术还公开了一种检测低比例嵌合变异的反应体系及其在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。本发明专利技术方法具有富集放大突变序列的作用，能检测低至0.1％的嵌合变异，灵敏度大为提高，在临床诊断嵌合变异的病例中具有很好的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测低比例嵌合变异的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种检测低比例嵌合变异的方法。

技术介绍

[0002]嵌合现象是指从单一受精卵发育而成的同一个体细胞有不同的遗传组成的现象，嵌合现象既可发生在染色体层面，也可发生在基因水平，而且其分布有多种模式，包括全身分布，局限在某个组织的分布。嵌合变异可存在于体细胞和/或生殖细胞，当嵌合变异仅发生在生殖细胞时，父母一般无症状，但会产生具有疾病状态的子代。这给临床生殖遗传的诊断增加了难度和挑战。因为，如果嵌合变异存在于父亲的精子或母亲的卵子中，经过血液检测根本无法发现基因突变的异常，只有对生殖细胞进行基因检测，才能找到致病的嵌合变异。然而，生殖细胞数量少，嵌合变异的比例又极低，要检测出生殖细胞中的嵌合变异对于基因检测技术要求非常高。
[0003]目前，对嵌合疾病的常用检测技术手段有细胞遗传学分析、微阵列芯片技术、二代测序技术等，但这些检测技术对嵌合变异的检测灵敏度还不够高，尤其是对低比例的嵌合变异就更难捕捉检测到。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决目前用于低比例嵌合变异的检测方法灵敏度不高的技术问题，提供一种检测低比例嵌合变异的方法，该方法能检测低至0.1％的嵌合变异，灵敏度大为提高。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
[0006]在本专利技术的一个方面，提供了一种检测低比例嵌合变异的方法，包括以下步骤：
[0007]针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；
[0008]将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。
[0009]在针对低比例嵌合变异的SNP位点设计引物和抑制探针之前，还可包括步骤：
[0010]对微量细胞进行基因组核酸扩增；
[0011]对所述扩增产物进行全基因组建库；
[0012]用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；
[0013]将杂交捕获的文库进行深度测序，以捕捉到低比例基因嵌合变异。
[0014]所述微量细胞包括一个或若干个细胞。
[0015]所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。
[0016]在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测低比例嵌合变异的的反应体系，所述反应体系包括：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑
制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
[0017]所述检测体系还包括聚合酶和基因组DNA，所述检测体系为PCR扩增反应体系。
[0018]在本专利技术的另一方面，还提供了一种检测低比例嵌合变异的试剂盒，包含针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
[0019]在本专利技术的另一方面，还提供了上述反应体系在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。
[0020]在本专利技术的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备胚胎植入前单基因遗传病诊断产品中的应用。
[0021]本专利技术检测低比例嵌合变异的方法，具有富集放大突变序列的作用，灵敏度高、特异性强，在临床诊断嵌合变异的病例中具有很好的应用前景。
附图说明
[0022]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0023]图1是本专利技术实施例1的部分SNP位点经BDA扩增后LOD检测结果图；
[0024]图2是本专利技术实施例2两例精液样本呈现嵌合可能性的具体信息图；
[0025]图3是本专利技术实施例2利用BDA技术对精子嵌合变异的验证结果图。
具体实施方式
[0026]实施例1证明抑制探针置换扩增(Blocker Displacement Amplification，BDA)技术在不同位点中和不同比例浓度范围内的普适性
[0027]1候选标准品样本的筛选(生物信息学分析)
[0028]1.1筛选合适的标准品来源样本：对14例志愿者样本(编号缩写LJF,YHX,YYX,CLL,GX,ZW,BW,TR,LSS,WJP,LRQ,XX,CMM,DBH)进行WES(人类全外显子捕获测序)测序并分析外显子区域的SNP的分型。
[0029]实验结果：分析这14例测序数据中外显子区域的SNP分型并进行比较，最后筛选出一对配对样本(LJF，CMM)用于后续的标准品制备。这组配对样本中找到320个SNP位点可以用于后续的BDA设计，这320个SNP位点在LJF样本中均为和基因组REF基因型相同的纯合SNP分型，在CMM样本中均为和基因组ALT基因型相同的纯合SNP分型。320个SNP位点可见表1。
[0030]表1 320个SNP位点
[0031][0032][0033][0034][0035][0036][0037][0038]1.2分析内控样本WES数据中的外显子区域SNP位点信息，从中找出1000个杂合的SNP位点。
[0039]实验结果：分析内控样本LJF的WES数据中外显子区域的SNP分型信息，共找到1247个AF＝0.4
‑
0.6的杂合SNP位点。1247个SNP位点可见表2。
[0040]表2 1247个杂合SNP位点
[0041][0042][0043][0044][0045][0046][0047][0048][0049][0050][0051][0052][0053][0054][0055][0056][0057][0058][0059][0060][0061][0062][0063][0064][0065][0066][0067]2.标准品的制备
[0068]2.1标准品样本DNA的提取
[0069]根据WES数据的分析结果，选取LJF和CMM配对样本用于后续标准品的制备，其中LJF作为野生型DNA样本，CMM作为突变型DNA样本。采集LJF和CMM的外周血各10mL用于基因组DNA的提取，血液基因组DNA提取的方法包括如下步骤：
[0070]1)取200μL血液样本到2.0mL的离心管中，若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足至200μL，再进行下一步实验。
[0071]2)加入200μL Buffer GB和20μL Proteinase K溶液至上述样品中，充分振荡混匀。
[0072]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测低比例嵌合变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在针对低比例嵌合变异的SNP位点设计引物和抑制探针之前，还可包括步骤：对微量细胞进行基因组核酸扩增；对所述扩增产物进行全基因组建库；用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；将杂交捕获的文库进行深度测序，以捕捉到低比例基因嵌合变异。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量细胞包括一个或若干个细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。5.一种检测低比例嵌合变异的的反应体系，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松长，徐晨明，黄荷凤，罗俊峰，汪进平，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：