基于数字PCR技术的SMA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于数字PCR技术的SMA检测试剂盒。本研究利用数字PCR检测技术，在同一反应中同时检测SMN1基因和SMN2基因拷贝数，且同时针对SMN1基因微小突变以及其他基因的检测，提高诊断准确率，简化操作流程，提高时效性。可应用于SMA携带者筛查、临床确诊和疾病分型等，并且节约检测成本。并且节约检测成本。并且节约检测成本。

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR技术的SMA检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及基于数字PCR技术的SMA检测试剂盒。

技术介绍

[0002]脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)，是一组脊髓前角细胞变性,导致对称肌无力和肌萎缩为特征的常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，为一种常见的运动神经元疾病。典型表现是肌无力、肌张力低、肌萎缩，正常站立、行走等运动功能受限等，运动发育显著落后于正常儿童，甚至无法完成如咀嚼、吞咽、呼吸等一些维持生命活动的最基本动作，但智力发育正常。患者临床表现差异性大,根据发病年龄、获得的运动功能及病情进展速度,可以将SMA分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，其中，Ⅰ型SMA表型最为严重。SMA表型的严重程度和SMN2基因的拷贝数相关。
[0003]任何年龄、种族、性别的人都有可能患上SMA。SMA新生儿发病率在1/5000
‑
1/10000，SMA产前携带率为1/35
‑
1/50，家庭高危率：约1/1600。
[0004]SMN基因定位于5q13区，具有两个高度同源的基因拷贝：SMN1和SMN2。SMN1基因表达完整而稳定的SMN功能蛋白，是SMA的决定性基因。SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2基因与SMN1基因序列高度相似，仅存在5个碱基的差异，分别位于第7、8外显子和第6、7内含子中，其中第7外显子上的C/T的差异，导致SMN2在初级转录产物pre
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mRNA剪切加工时发生外显子跳跃，产生的mRNA较SMN1缺失第7外显子。研究表明，只有10％
‑
15％的SMN2基因能表达为全长的SMN蛋白，因此也被成为SMA的补偿基因。已有统计表明，约95％的SMA患者为SMN1基因纯合缺失型(第7和/或第8外显子纯合缺失)，约5％为SMN1基因杂合缺失型(第7和/或第8外显子杂合缺失)与点突变形成复合杂合突变所致。
[0005]根据SMA的致病基因特点，现有的基因诊断技术主要是分析SMN1基因第7外显子和/或第8外显子是否有缺失及缺失数目，但SMN1基因第8外显子不参与SMN蛋白表达，检测SMN1基因第8外显子是否缺失临床意义不大。目前主要有限制性片段长度多态性(RFLP)、多重连接探针扩增(MLPA)和荧光定量PCR(qPCR)。RFLP操作简便、对设备要求不高，但它只能检测SMN1外显子7纯合缺失。其首先使用特异探针与目标序列杂交，特异探针包含两个寡核苷酸，仅当两个寡核苷酸成功杂交才能进行连接，连接后进行多重PCR扩增，产生不同长度的产物。然后在毛细管测序仪上分析不同大小的产物，峰高的变化反映了基因的缺失。如果检测的靶序列引物区发生点突变或者缺失，那么相应探针的扩增峰便会降低或缺失，容易引起假阴性结果。qPCR操作简便、快速，但其需要依赖标准曲线进行定量，且现有的试剂盒不能同时检测SMN1外显子7、8和SMN2基因。目标基因与内参基因的扩增效率差异是否稳定符合2
‑
ΔΔCt相对定量算法的数学基础也有待验证，因而该方法在携带者检测中的可靠性尚值得商榷。另外，这两种方法不适合用于检测SMN1基因点突变(包括错义、无义、移码、剪切位点突变)。
[0006]另外，由于SMA携带者人群基数大，现有方法大部分检测全血样本，核酸前处理成本高、耗时长，不利于大规模筛查。
[0007]目前尚无能够实现一管检测SMN1基因和SMN2基因拷贝数、点突变以及其他基因的技术方案。因此，本领域仍然需寻求一种新的同时SMN1基因和SMN2基因拷贝数以及点突变的方法，提高诊断准确率，简化操作流程，提高时效性。可应用于SMA携带者筛查、临床确诊和疾病分型等。

技术实现思路

[0008]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于数字PCR技术的SMA检测试剂盒，用于解决现有技术中SMA诊断复杂、不够便捷的问题。
[0009]本专利技术的一方面提供了一种利用数字PCR技术检测SMN1基因和SMN2基因的试剂盒，所述试剂盒至少含有以下探针和引物：
[0010]a.用于检测检测SMN1或SMN2第7外显子上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0011]b.用于检测SMN1第7外显子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0012]c.用于检测SMN2第7外显子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]d.以下任一组或几组用于检测靶基因的探针和引物：
[0014][0015][0016]以上每条所述探针的两端都分别连接有一对互不相同的荧光报告基团、荧光淬灭基团。
[0017]本申请的技术方案应配合数字PCR应用，具有较高的特异性和灵敏度，且对微小突变以及其他基因也可检出。
[0018]以上所述所有探针和引物都可以在一个反应体系内。
[0019]进一步地，所述试剂盒还包含用于检测内参基因的引物和探针。所述内参基因可以为MRPS18C，对应的，用于检测内参基因MRPS18C的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所
示。
[0020]进一步地，所述探针5
’
端标记的荧光基团是选自FAM、HEX、TET、ROX、CY3、CY5、CY5.5、VIC、JOE、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor647、或Alexa Fluor 750任一种，3
’
端的标记是TAMRA、Dabcyl、BHQ
‑
1、BHQ
‑
2、BHQ
‑
3、MGB、Eclipse中任一种。
[0021]进一步地，所述试剂盒还包括以下组分中的任一种或几种：PCR反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照。
[0022]进一步地，所述试剂盒还包括以下试剂中的任一种或几种：Tris
‑
HCl缓冲液、MgCl2、dNTPs、KCl、NH4Cl、DNA聚合酶、水、NaOH，莎梵婷，DMSO，蔗糖，Chelex
‑
100。
[0023]进一步地，所述试剂盒的检测对象为全血、血斑、口腔拭子、唾液、羊水、或精液等。对于口腔拭子和唾液，可以直接进行PCR扩增检测，无需提取核酸。对于其他样本需要进行提取核酸，然后进行检测。
[0024]进一步地，所述试剂盒的检测对象，口腔拭子样本采样后需放置在0.5mL
‑
1mL的口腔拭子裂解液中。
[0025]进一步地，所述试剂盒结合数字PCR使用，数字PCR设定程序为：50℃预处理10min，95℃预变性25min，进入PCR循环，94℃20S，56℃40S，50个循环。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用数字PCR技术检测SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒至少含有以下探针和引物：a.用于检测检测SMN1或SMN2第7外显子上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；b.用于检测SMN1第7外显子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；c.用于检测SMN2第7外显子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；d、以下任一组或几组用于检测靶基因的探针和引物：
以上每条所述探针的两端都分别连接有一对互不相同的荧光报告基团、荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中所有所述的引物和探针都在一个反应体系内。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于检测内参基因的引物和探针。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为MRPS18C，用于检测内参基因MRPS18C的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。5.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于：所述探针5
’
端标记的荧光基团选自FAM、HEX、TET、ROX、CY3、CY5、CY5.5、VIC、JOE、Alexa Fluor 488、AlexaFluor ...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈燕龙，徐刚伟，赵哲浩，张京红，姚湾，谭凯妮，
申请(专利权)人：湖南圣洲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：