基于水解的探针和STR基因分型的方法技术

本发明专利技术涉及对含有短串联重复(STR)基因座的样品进行基因分型的领域。更具体地，本发明专利技术公开了包含探针阵列的物质组合物和依赖于识别RNA：DNA碱基配对然后切割含RNA链来对这些基因座进行基因分型的方法。通过测量嵌合DNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于水解的探针和STR基因分型的方法


[0001]本专利技术涉及包含短串联重复序列(STR)的基因分型样品。本专利技术公开了由3个DNA区域组成的荧光标记的杂合DNA：RNA探针，其中一个区域包含至少1个RNA残基，而另一个区域包含至少1个猝灭物(quencher)。本专利技术还涉及利用所述探针和RNase H2酶的方法，所述RNase H2酶识别当探针与含有STR的DNA样品杂交时形成的RNA：DNA双链体。该酶切割含有猝灭物的区域，导致荧光信号增加。当样品中的重复数与探针中的重复数完全对应时，杂交、随后的酶促识别和随后的探针切割在较高温度下发生。本专利技术的探针和方法在用于法医DNA分析的便携式设备中特别有用。

技术介绍

[0002]脱氧核糖核酸(DNA)用于个体的识别目的，包括亲属关系分析和法医DNA基因分型。为此目的检查了DNA中的多态性，例如短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)。STR仍然是许多应用选择的多态性。STR基因座的特征是短的(通常为4个核苷酸)重复序列，这些重复序列在特定群体中的重复数量是多态性的。[1][0003]在人类基因组中，包含这种特定类型多态性的不同区域被识别。通过分析大量STR基因座获得了统计上独特的概况(profile)以用于法医目的，这些STR基因座大多位于人类基因组的非编码区。在欧洲，通常检查一组12个STR，称为欧洲标准集(ESS)。该组现在扩展了5个额外的基因座。[2]在美国，使用组合DNA索引系统(CODIS)，其包含13个核心基因座和7个额外的基因座。[3][0004]通常，这些基因座通过毛细管电泳(CE)进行分析，毛细管电泳是一种DNA大小分离技术。CE是一个漫长的过程，其需要庞大的设备。此外，电泳所需的高电位意味着需要精确(accurate)的电源。总之，CE并不适合在便携式设备中实现。单机设备，例如RapidHIT(Applied Biosystems)[4]己上市。这个特殊的设备质量为82kg，因此妨碍了常规DNA痕迹的现场分析。
[0005]犯罪调查将从现场DNA分析中受益匪浅，因为这可以加快调查速度。除此之外，在芯片上实施这些分析将降低污染风险，避免对训练有素的人员的需求，并降低社会成本。[5][0006]已经描述了可能集成在便携式设备中的STR基因分型的替代检测方法。几乎所有这些方法都是基于杂交的方法，使用所谓的STR探针。STR基因座与SNP基因座相比相当长，这意味着需要长探针。基于杂交的方法依赖于双链体稳定性。样品和探针之间的部分错配，在此称为异源双链体形成，将导致双链体不稳定，这反映在较低的解链温度上。然而，探针越长，错配对双链体稳定性的影响就越小。由于探针中存在重复单元，不仅STR基因座根据定义很长，而且可能的等位基因具有高度的相似性：即使当探针和样品不共享相同数量的重复时，也存在大部分探针与样品完美匹配，只有一小部分显示与样品错配。
[0007]为了增加1个重复错配的不稳定效应(destabilising effect)，US9404148B2[6，7]描述了在溶液中使用的HyBeacon探针以及阻断剂寡核苷酸，从而缩短了探针长度。该测
定在由LGC商业化的ParaDNA设备中实施[8]。基因分型是通过传统的解链曲线分析完成的。该系统的缺点是探针设计限制，使得无法设计能够对完整DNA概况所需的所有基因座进行基因分型的系统，并且需要第二个寡核苷酸作为阻断剂，从而显著增加了系统的复杂性。描述了使用多种合成寡核苷酸的其他系统，例如US9783842B[11]描述了基于差异杂交的方法，US7501253B2[12]描述了分支迁移测定，以及US6753148B2描述了基于探针和样品双链体稳定性的方法，即使用捕获探针和报告探针的“夹心杂交法”和“环出法”[13]。类似的缺点，例如对于HyBeacon探针描述的增加的复杂性，在后面的系统中也会遇到。
[0008]US12/276849[9，10]描述了dpFRET方法，其是一种基于解链曲线的方法，省略了阻断寡核苷酸的使用。该系统的缺点是使用了有毒的嵌入染料，其也改变了寡核苷酸的解链行为。
[0009]除了使用多种合成寡核苷酸外，酶促切割步骤的引入是一种有效的策略，以显著提高依赖于双链体去稳定化的测定的特异性。使用dpFRET方法或任何其他依赖于探针和样品之间物理距离的方法，解链峰相对较宽，因为在退火过程中已经产生了信号。相反，核酸内切酶依赖于DNA的正确碱基配对。因此，仅在双链体形成后才会产生信号，从而产生更窄和更独特的峰。
[0010]用于基因分型分析的适当的酶是RNase H2酶，其识别RNA：DNA双链体并切割RNA链。US20160130673A1[19]描述了组合使用核酸内切酶活性(例如源自RNase H)和核酸外切酶(例如源自聚合酶)用于检测靶序列。所述系统与探针非常相似，但使用了嵌合DNA
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RNA
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DNA探针。探针靶向目标小区域，例如SNP或INDEL，并且依赖于探针的RNA区域是否与目标靶区域杂交。探针被进一步设计，使错配位于双链体的中心，这是最不稳定的位置。这种分析产生二元答案(即RNA部分是否杂交)，这是非常适合分析双等位基因座例如SNP基因座的特征。然而，这种策略不能应用于STR探针，因为这些DNA区域的特征在于多个可能的等位基因，这些等位基因的长度不同，而不仅仅是序列不同。实际上，这种探针的传感部分不能定位在探针的中心，而是更靠近末端。因此，对该探针的一些结构调整(例如锚区域和RNA碱基的定位)是必不可少的。由于目标基因座比SNP基因座长，所以错配的不稳定效应降低。这意味着即使发生错配，RNA部分也会杂交，从而使评估和数据分析的方法复杂化。
[0011]总之，显然仍然非常需要设计一种STR基因分型探针和方法，该探针和方法产生高信噪比、没有设计限制并且可以在便携式设备中实施。
附图说明
[0012]图1：探针设计。探针从5
′
至3
′
或从3
′
至5
′
由以下组成：(i)第一侧翼区域，其用作锚以确保探针的适当退火并防止滑动；(ii)重复区域，其包含一个或多个重复并包含至少一个荧光部分；(iii)第二侧翼区域，其用作传感器，包含至少一个核糖核苷酸和能够猝灭所述荧光团的至少一个猝灭物。
[0013]图2：酶消化前的探针：样品(异源)
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双链体。如果探针和样品具有相同的重复数，表明完全互补，则形成同源双链体。然而，当探针和样品不共享相同数量的重复时，将形成异源双链体，其特征在于较低的杂交和解链温度。
[0014]图3：杂交时的荧光。在高温下，DNA是单链的(变性)并且探针保持完整。冷却时，探
针和样品退火。RNase H2酶在RNA位置识别并切割探针，引起猝灭物和荧光团彼此分离。这反过来又会导致荧光增加。注意温度轴的反方向。
[0015]图4：杂交时的荧光，3种不同的情况。一个样品与3种不同的探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.组合物，其包含：a)寡核苷酸探针阵列，其中所述探针中的每一个包含从5
′
到3
′
或从3
′
到5的以下3个区域：I.包含至少一个核苷酸的第一侧翼区域，其与直接紧邻目标特定DNA序列的区域退火并且具有比第二侧翼区域更高的解链温度，II.区域，其包含特定DNA序列，所述特定DNA序列与样品内的目标短串联重复区域退火并且其包含至少一个荧光团，和III.第二侧翼区域，其包含至少2个核苷酸，并且其包含至少一个核糖核苷酸和能够有效猝灭所述荧光团的至少一个猝灭物部分，其中所述荧光团和所述猝灭物部分通过至少一个核糖核苷酸彼此分开，和b)RNase H2酶，其能够通过在所述探针与所述样品杂交时识别RNA：DNA双链体来消化所述探针。2.根据权利要求1的包含寡核苷酸探针阵列的组合物，其中所述猝灭物附接到所述探针中每一个的3
′
或5
′
末端。3.根据权利要求1
‑
2的包含寡核苷酸探针阵列的组合物，其中所述荧光团附接到所述探针中每一个的第二侧翼区域的核苷酸上，并且其中所述猝灭物附接到所述探针中每一个的目标特定DNA序列的核苷酸上。4.根据权利要求1
‑
3的包含寡核苷酸探针阵列的组合物，其中所述荧光团是荧光素衍生物。5.根据权利要求1
‑
4的包含寡核苷酸探针阵列的组合物，其中所述猝灭物是Iowa Black FQ猝灭物。6.根据权利要求1
‑
5的包含寡核苷酸探针阵列的组合物，其中所述探针中的每...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥利维尔，
申请(专利权)人：根特大学，
类型：发明
国别省市：