一种基于检测ITM2A基因表达水平的脓毒症诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种新型脓毒血症分子标志物ITM2A及其应用。本发明专利技术还公开了ITM2A基因或蛋白的检测试剂在制备脓毒血症诊断试剂盒中的用途。本发明专利技术的用于ITM2A基因实时荧光定量PCR检测的引物具有高度特异性和灵敏度，能够用于临床上脓毒血症的高效诊断。用于临床上脓毒血症的高效诊断。用于临床上脓毒血症的高效诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种基于检测ITM2A基因表达水平的脓毒症诊断试剂盒


[0001]本专利技术涉及临床分子诊断专利
，具体涉及一种新型脓毒血症分子标志物ITM2A及其应用。

技术介绍

[0002]脓毒血症是由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应综合征，通常产生危及生命的器官功能损害，主要损伤的脏器包括：肺、血液循环系统、泌尿系统、腹腔等。全球范围内，脓毒血症(sepsis)的病死率在25％
‑
30％，如果病人还存在休克的症状，即脓毒性休克，此时患者病死率将达到40％
‑
50％。
[0003]已有的一些脓毒血症标志物如IL
‑
6(白介素
‑
6)、CRP(C
‑
反应蛋白)和PCT(降钙素原)等在早期脓毒血症诊断中都存在特异性和灵敏度低的问题。因此，寻找高敏感性和特异性的分子标志物并确定其适宜的检测方法，对于脓毒血症的诊治至关重要。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术对公共基因数据库的相关数据进行收集和生信分析，发现ITM2A基因在脓毒症患者血液中的表达比健康对照组显著低；进一步采集临床样本通过实时荧光定量PCR方法进行了验证，获得结果与生信分析结果一致。
[0005]具体地，本专利技术第一方面提供了ITM2A基因或蛋白的检测试剂在制备脓毒血症诊断试剂盒中的用途。
[0006]在某些实施方式中，所述ITM2A基因的检测试剂包括用于ITM2A实时荧光定量PCR检测的引物。
>[0007]在某些实施方式中，所述ITM2A蛋白的检测试剂包括ITM2A特异性抗体。
[0008]在某些实施方式中，所述用于ITM2A实时荧光定量PCR检测PCR的引物包括：Human
‑
ITM2A正向引物5
’‑
CGCGGCAAGACGTGGAG
‑3’
(SEQ ID NO：1)；Human
‑
ITM2A反向引物5
’‑
CCACTCGCCAGTTTGCCA
‑3’
(SEQ ID NO：2)。
[0009]本专利技术第二方面提供了一种脓毒血症诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于待测样本中ITM2A的mRNA表达量的检测系统。
[0010]在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于待测样本RNA提取的分离系统。
[0011]在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于确定ITM2A表达量高/低分界标准的数学模型及阈值。
[0012]在某些实施方式中，所述待测样本为人外周血单个核细胞(PBMC)。
[0013]在某些实施方式中，所述分离系统包括用于从外周血中分离PBMC的分离液，比如淋巴细胞分离液、Trizol试剂等；用于从PBMC中提取分离RNA的试剂比如氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水等。
[0014]在某些实施方式中，ITM2A基因检测系统包括用于RNA反转录的试剂、PCR扩增cDNA用的试剂、引物等。
[0015]在某些实施方式中，所述检测系统包含ITM2A基因表达检测试剂。
[0016]在某些实施方式中，所述检测试剂包括用于ITM2A实时荧光定量PCR的引物。
[0017]在某些实施方式中，用于ITM2A实时荧光定量PCR的引物序列为：Human
‑
ITM2A正向引物5
’‑
CGCGGCAAGACGTGGAG
‑3’
(SEQ ID NO：1)；Human
‑
ITM2A反向引物5
’‑
CCACTCGCCAGTTTGCCA
‑3’
(SEQ ID NO：2)。
[0018]在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含内参GAPDH的检测引物以及任选的说明书。
[0019]在某些实施方式中，所述GAPDH的检测引物序列为：Human
‑
GAPDH正向引物5
′‑
AGCCACATCGCTCAGACAC
‑3′
(SEQ ID NO：3)；Human
‑
GAPDH反向引物5
′‑
GCCCAATACGACCAAATCC
‑3′
(SEQ ID NO：4)。
[0020]在某些实施方式中，作为用于确定ITM2A的mRNA表达量高/低分界标准的数学模型，其为荧光定量PCR的
△△
CT计算公式。
△△
CT是荧光定量计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的特定基因表达量拷贝数差别或变化比率。Ct＝
‑
1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
△
Ct(n)＝Ct(目的基因)
‑
Ct(内参基因)；
△△
CT(n)＝
△
Ct(n)
‑△
Ct(1)。基因起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得样本中某基因的Ct值，即可计算出该样品中某基因的起始拷贝数。本专利技术中，目的基因是ITM2A，内参基因是人类GAPDH基因。本专利技术选取0.50为试剂盒诊断脓毒症的阈值，不高于该值认为患者患脓毒症。
[0021]在某些实施方式中，所述数学模型是检测ITM2A基因的荧光定量PCR的
△△
CT计算公式：
△
Ct(n)＝Ct(ITM2A基因)
‑
Ct(内参基因)；
△△
CT(n)＝
△
Ct(n)
‑△
Ct(1)，其中n为扩增反应的循环次数；当
△△
CT值不高于0.50时，提示患有脓毒症。
[0022]本专利技术第三方面提供了ITM2A基因激活剂在制备脓毒血症治疗药物中的用途。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0024]本专利技术从脓毒血症(包括成人和儿童)和健康人群的血液入手，结合实时荧光定量PCR和芯片数据的分析方法来探究ITM2A的表达与脓毒血症的关系，证明了ITM2A在脓毒血症患者(包括成人和儿童)的血液中特异性低表达。ITM2A可以作为诊治脓毒血症患者的标志，指导临床医师指定合适的治疗方案。本专利技术还提供了用于脓毒血症诊断的荧光定量PCR试剂盒，其中的引物具有高度特异性、灵敏度。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1示出PBMC中ITM2A的表达情况(N＝5/组)。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ITM2A基因或蛋白的检测试剂在制备脓毒血症诊断试剂盒中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ITM2A基因的检测试剂包括用于ITM2A实时荧光定量PCR检测的引物；所述ITM2A蛋白的检测试剂包括ITM2A特异性抗体。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用于ITM2A实时荧光定量PCR检测PCR的引物包括：Human
‑
ITM2A正向引物SEQ ID NO：15
’‑
CGCGGCAAGACGTGGAG
‑3’
(SEQ ID NO：1)；Human
‑
ITM2A反向引物5
’‑
CCACTCGCCAGTTTGCCA
‑3’
(SEQ ID NO：2)。4.一种脓毒血症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于待测样本中ITM2A的mRNA表达量的检测系统；任选地，所述试剂盒进一步包括用于待测样本RNA提取的分离系统和/或用于确定ITM2A表达量高/低分界标准的数学模型及阈值；优选地，所述待测样本为人外周血单个核细胞。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测系统包含ITM2A基因表达检测试剂；优选地，所述检测试剂包括用于ITM2A实时荧光定量PCR的引物，其序列为：Human
‑
ITM2A正向引物5
’‑
CGCGGCAAGACGTGGAG
‑3...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋振举，杨依霖，林梦娜，邢玲玉，童朝阳，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：