一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用，涉及生物技术领域。该试剂盒包括PCR预混反应液，阳性对照品，及空白对照。本发明专利技术能够分别进行5个位点的定性检测。使用时，仅需将样本分别与探针引物组合物或PCR预混液混合，即可上机检测。每个反应体系检测一个位点的多态性，结果判读直观，从而降低了对检测时限、操作熟练度、数据分析等的严苛要求，降低了整体检测难度。降低了整体检测难度。降低了整体检测难度。

【技术实现步骤摘要】
一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]高血压是我国人群脑卒中和冠心病发病及死亡的主要因素，近50年来我国高血压患病率呈明显上升趋势。临床常用的抗高血压药主要包括血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、β受体阻滞剂、噻嗪类利尿剂以及钙通道阻滞剂(CCB)。临床实践发现对于相同的抗高血压药物，不同患者对药物的反应存在个体化差异，而基因多态性是药物反应个体化差异的重要影响因素。
[0003]血管紧张素Ⅱ是肾素
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血管紧张素系统的重要体液因子，其90％以上的效应通过血管紧张素Ⅱ的1型受体(AGTR1)介导。AGTR1的1166A>C基因多态性可影响ARB类药物的治疗效果，C/C基因型个体对ARB类药物更加敏感，降压效果更好。
[0004]血管紧张素转换酶(angio tensin converting enzyme，ACE)是肾素
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血管紧张素系统的关键酶，由ACE基因编码，是ACEI类药物的作用靶点。ACE基因的第16号内含子中存在插入(Insertion,I)/缺失(Deletion,D)序列，会导致ACE基因呈现I/D多态性，从而影响ACEI类药物的疗效。2017年发布的《高血压合理用药指南(第2版)》(以下简称“指南”)中提出“ACE I/D多态性可影响血浆ACE的水平，DD基因型个体血浆ACE的活性升高，依那普利治疗后ACE活性下降更明显；初治的高血压患者中，DD型患者福辛普利的降压疗效增强；在高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者中，DD基因型患者服用依那普利和赖诺普利后心功能改善程度优于ID和II基因型患者；II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利时肾功能下降更明显”。
[0005]β肾上腺素受体是β受体阻滞剂类药物的作用靶点，由ADRB1基因编码。该受体属于G蛋白偶联受体超家族，通过与Gs蛋白偶联调节细胞内cAMP和L型钙通道的开放频率。ADRB1的1165G>C(Gly389Arg)多态性可影响β受体阻滞剂的疗效。“指南”中提到Arg389纯合子高血压患者应用美托洛尔后，血压下降程度是Gly389Arg杂合子基因型个体的3倍；Arg389纯合子基因型心力衰竭患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后左室射血分数改善情况更佳。建议临床医师在应用β1受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测，并根据其基因型调整用药剂量，以提高疗效。
[0006]CYP2D6是CYP450家族成员之一，已知经其催化代谢的药物多达80余种，CYP2D6基因多态性直接影响其酶活性，进而影响药物的代谢效率。不同个体CYP2D6活性最大可相差1000倍。中国人群中CYP2D6常见的导致酶活性降低的等位基因是CYP2D6*10，该等位基因导致中间代谢(IM)表型，美托洛尔药物代谢效率降低。“指南”提到“酒石酸美托洛尔常释制剂、奈必洛尔盐酸盐、卡维地洛常释制剂主要经CYP2D6代谢”。FDA批准的琥珀酸美托洛尔药物说明书中提示美托洛尔主要由CYP2D6代谢。在《β受体阻滞剂在高血压应用中的专家指导
建议》文章中提到，CYP2D6基因的多态性是决定美托洛尔药代动力学参数的关键因素，临床应用应当个体化。
[0007]CYP2C9是CYP450家族成员之一，占肝微粒体P450总量的20％，该酶催化约12％的临床常用药物。中国人群中主要存在的遗传变异为CYP2C9*3，导致酶活性降低。“指南”中提到CYP2C9基因的某些位点多态性会影响氯沙坦活性产物EXP
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3174的生成，进而影响降压效果。携带CYP2C9*3等位基因的个体服用氯沙坦后，EXP
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3174的生成减少，氯沙坦的代谢率降低。CYP2C9*1/*3基因型个体中氯沙坦的降压作用下降，需适当增加用药剂量以增强降压疗效。
[0008]《医疗机构临床检验项目目录2013年版》在“五、临床分子生物学及细胞遗传学检验目录下4、用药指导的分子生物学检验”推荐进行CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G>C)、AGTR1(1166A>C)、ACE(I/D)检测。
[0009]目前，有多篇公开专利要求保护多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒。但这些专利中的检测试剂盒存在检测限高、灵敏度差、检测时间长等缺陷。如CN201810245896、CN201910614761专利使用溶解曲线法，溶解曲线法灵敏度不高；扩增时间长达3小时，无法实现快速扩增。又如CN201811032803专利使用的是在ARMS PCR基础上，对TaqMan探针进行了改造的分型方法。该专利使用的锁核酸探针，价位大约是TaqMan探针的5
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10倍，成本较高。灵敏度仅达到0.1ng/μL。CN111100929A专利使用多重PCR法，在一个反应中检测两个位点的基因型，特异性较差，且一个位点的检测结果需计算两通道的CT值之差来确定，结果判读不直观。CN106755560B专利使用多重PCR法，在一个反应管中使用4个荧光通道，同时检测两个位点的基因型。但反应液中不含酶，酶混合液需要单独添加，使用便利性不够。
[0010]CN201610732578专利整体使用taqman探针，公用上下游引物，两条探针中间有单个位点突变。但是该检测试剂盒在使用过程中存在稳定性较差的问题，通过实验测试得到如图所示结果，ACE I/D位点在37℃24小时内，荧光信号值大幅降低，且空白对照在检测中出现突变信号，影响结果判读。众所周知，在进行体外检测过程中，受环境温度、检测条件限制、操作人员熟练度等因素的影响，探针的稳定性程度直接影响着试剂盒检测准确性和实用性，而现有技术中由于ACE I/D位点稳定性无法满足上述要求，进而导致操作使用试剂盒的条件更为苛刻。
[0011]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于提供一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物、试剂盒及应用以提高高血压5种相关基因多态性检测的准确性、快捷性和稳定性。
[0013]本专利技术是这样实现的：
[0014]本专利技术提供了一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物，其包括：分别用于检测AGTR1基因1166A>C位点、ACE基因I/D位点、ADRB1基因1165G>C位点、CYP2D6*10位点、CYP2C9*3位点的引物探针组合物；
[0015]其中，用于检测AGTR1基因1166A>C位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.1
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2所示的用于扩增AGTR1基因1166A>C位点的引物、如SEQ ID NO.3所示的AGTR1野生型探针和
如SEQ ID NO.4所示的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高血压基因多态性检测的引物探针组合物，其特征在于，其包括：分别用于检测AGTR1基因1166A>C位点、ACE基因I/D位点、ADRB1基因1165G>C位点、CYP2D6*10位点、CYP2C9*3位点的引物探针组合物；其中，用于检测AGTR1基因1166A>C位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.1
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2所示的用于扩增AGTR1基因1166A>C位点的引物、如SEQ ID NO.3所示的AGTR1野生型探针和如SEQ ID NO.4所示的AGTR1突变型探针，如SEQ ID NO.5
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6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针；用于检测ACE基因I/D位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.8
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9以及SEQ ID NO.24所示的用于扩增ACE基因I/D位点的引物、如SEQ ID NO.10所示的ACE野生型探针和如SEQ ID NO.11所示的ACE突变型探针，如SEQ ID NO.5
‑
6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针；用于检测ADRB1基因1165G>C位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.12
‑
13所示的用于扩增ADRB1基因1165G>C位点的引物、如SEQ ID NO.14所示的ADRB1野生型探针和如SEQ ID NO.15所示的ADRB1突变型探针，如SEQ ID NO.5
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6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针；用于检测CYP2D6*10位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.16
‑
17所示的用于扩增CYP2D6*10位点的引物、如SEQ ID NO.18所示的CYP2D6*10位点野生型探针和如SEQ ID NO.19所示的CYP2D6*10位点突变型探针，如SEQ ID NO.5
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6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针；用于检测CYP2C9*3位点的引物探针组合物包括：如SEQ ID NO.20
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21所示的用于扩增CYP2C9*3位点的引物、如SEQ ID NO.22所示的CYP2C9*3位点野生型探针和如SEQ ID NO.23所示的CYP2C9*3位点突变型探针，如SEQ ID NO.5
‑
6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针；优选地，所述探针的5
’
端均标记有荧光报告基团，所述探针的3
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端均标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY；优选地，所述荧光报告基团为FAM、ROX或VIC；所述淬灭基团为MGB或BHQ2。2.一种高血压基因多态性检测的PCR预混反应液，其特征在于，其包括：分别用于检测AGTR1基因1166A>C位点、ACE基因I/D位点、ADRB1基因1165G>C位点、CYP2D6*10位点、CYP2C9*3位点的PCR预混反应液；其中，用于检测AGTR1基因1166A>C位点的PCR预混反应液包括：如SEQ ID NO.1
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2所示的用于扩增AGTR1基因1166A>C位点的引物、如SEQ ID NO.3所示的AGTR1野生型探针和如SEQ ID NO.4所示的AGTR1突变型探针，如SEQ ID NO.5
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6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针，以及PCR反应液；用于检测ACE基因I/D位点的PCR预混反应液包括：如SEQ ID NO.8
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9以及SEQ ID NO.24所示的用于扩增ACE基因I/D位点的引物、如SEQ ID NO.10所示的ACE野生型探针和如SEQ ID NO.11所示的ACE突变型探针，如SEQ ID NO.5
‑
6所示的用于内控的引物和如SEQ ID NO.7所示的用于内控的探针，以及PCR反应液；
用于检测ADRB1基因1165G>C位点的PCR预混反应液包括：如SEQ ID NO.12
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13所示的用于扩增ADRB1基因1165G&gt;C位点的引物、如SEQ ID NO.14所示的ADRB1野生型探针和如SEQ ID NO.15所示的ADRB1突变型探针，如SEQ ID NO.5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：方闪闪，曾佳，陈雯清，王维旭，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：