一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学及生物技术领域。引物和探针针对2号外显子上的Codon12突变G12D、Codon13突变G13D、3号外显子上的Codon61突变Q61K及3号外显子上的Codon61突变Q61R，试剂盒包含上述的引物和探针，还包括内参体系、10

【技术实现步骤摘要】
一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学及生物


技术介绍

[0002]RAS基因是一种原癌基因，主要调控细胞生长、增殖和分化。RAS蛋白位于细胞膜内侧，与三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)有很强的的亲和力，在细胞生长分化信号传递方面有重要作用。当RAS基因发生突变时，RAS蛋白结构随之发生改变，与GDP结合能力减弱，可不通过生长信号调节便与GTP结合自身活化，进而造成细胞不可控的进行增殖，导致癌症的发生。
[0003]大量研究表明，RAS基因发生突变后，会导致EGFR下游的信号通路活化异常，从而降低针对EGFR靶向药物的疗效(如西妥昔单抗和帕尼单抗等)。明确RAS基因的突变状态对于指导结直肠患者使用抗EGFR靶向药物具有重要意义。
[0004]NRAS基因是RAS原癌基因家族的成员，位于1号染色体短臂上(1p31)，负责编码并制造一种称为NRas的蛋白，NRas蛋白通过参与RAS
‑
RAF
‑
MEK
‑
ERK通路，调控基因转录活动和细胞周期，与细胞增殖密切相关。
[0005]黑色素瘤发病率及致死率近几年来逐年提高，占全部肿瘤的3％左右，是皮肤癌症中最致命的类型之一。其中大约25％的黑色素瘤是由于NRAS基因的突变导致的，因此NRAS基因对于黑色素瘤的检测及治疗具有至关重要的作用。
[0006]目前对于基因突变的检测方法较多，如Sanger测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(HRM)、荧光定量PCR法、数字PCR法等。现阶段较为常用的方法为Sanger测序法和荧光定量PCR法，Sanger测序法为基因突变检测等基因检测分析的金标准，对每一个碱基的读取具有极高的准确率，但同时也存在一些缺点，如灵敏度偏低、耗时较长；荧光定量PCR法也是一种常见的基因检测方法，但灵敏度依然存在一定的限制，由于NRAS基因突变检测较少且突变率偏低，因此需要一种较高灵敏度和准确度的检测方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了检测人NRAS基因突变的引物、探针和试剂盒，通过简单操作将检测液相导入芯片中直接进行扩增，可同时检测多种NRAS基因突变：Codon12突变型：G12D；Codon13突变型：G13D；Codon61突变型Q61K和Q61R，具有极高的灵敏度，检测限可达200copies/mL。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种检测人NRAS基因突变的引物和探针，针对2号外显子上的Codon12突变G12D的引物和探针的序列为：
[0010]正向引物NF1：5
′‑
TGCTGGTGTGAAATGACTG
‑3′
；
[0011]反向引物NR1：5
′‑
CTGGATTAGCTGGATTGTCA
‑3′
；
[0012]检测探针NP1：5
′
荧光基团
‑
AACACCATCTGCTC
‑3′
猝灭基团；
[0013]封阻探针NB1：5
′‑
CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT
‑3′
phosphorylation；
[0014]针对2号外显子上的Codon13突变G13D的引物和探针的序列为：
[0015]正向引物NF2：5
′‑
GGTGTGAAATGACTGAGTACA
‑3′
；
[0016]反向引物NR2：5
′‑
TGGTTCTGGATTAGCTGGA
‑3′
；
[0017]检测探针NP2：5
′
荧光基团
‑
CAAC+A+T+CACCTGCT
‑3′
猝灭基团；
[0018]封阻探针NB2：5
′‑
CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT
‑3′
phosphorylation；
[0019]针对3号外显子上的Codon61突变Q61K的引物和探针的序列为：
[0020]正向引物NF3：5
′‑
AAACCTGTTTGTTGGACAT
‑3′
；
[0021]反向引物NR3：5
′‑
ATTGGTCTCTCATGGCACT
‑3′
；
[0022]检测探针NP3：5
′
荧光基团
‑
CTCTTCT+T+T+TCCAGC
‑3′
猝灭基团；
[0023]封阻探针NB3：5
′‑
CTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGT
‑3′
phosphorylation；
[0024]针对3号外显子上的Codon61突变Q61R的引物和探针的序列为：
[0025]正向引物NF4：5
′
荧光基团
‑
CTCTTCTCGTCCAG
‑3′
猝灭基团；
[0026]反向引物NR4：5
′‑
ATTGGTCTCTCATGGCACT
‑3′
；
[0027]检测探针NP4：5
′
荧光基团
‑
CTCTTCT+T+T+TCCAGC
‑3′
猝灭基团；
[0028]封阻探针NB4：5
′‑
CTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGT
‑3′
phosphorylation。
[0029]进一步，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、ROX或CY5；
[0030]所述猝灭基团为MGB或Taqman探针(根据检测探针是否添加锁核酸修饰来决定)。
[0031]本专利技术还提供了一种检测人NRAS基因突变的试剂盒，其包含上述的引物和探针，还包括内参体系，所述内参体系引物和探针的序列为：
[0032]正向引物GF1：5
′‑
GCTCCCTCTTTCTTTGCAG
‑3′
；
[0033]反向引物GR1：5
′‑
AGTCCTTCCACGATACCAA
‑3′
；
[0034]内参探针GP1：5
′
荧光基团
‑
TCCTGCACCACCAACTGCTTAG
‑3′
猝灭基团。
[0035]GAPDH或G3PDH是甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase)的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人NRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，针对2号外显子上的Codon12突变G12D的引物和探针的序列为：正向引物NF1：5
′‑
TGCTGGTGTGAAATGACTG
‑3′
；反向引物NR1：5
′‑
CTGGATTAGCTGGATTGTCA
‑3′
；检测探针NP1：5
′
荧光基团
‑
AACACCATCTGCTC
‑3′
猝灭基团；封阻探针NB1：5
′‑
CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT
‑3′
phosphorylation；针对2号外显子上的Codon13突变G13D的引物和探针的序列为：正向引物NF2：5
′‑
GGTGTGAAATGACTGAGTACA
‑3′
；反向引物NR2：5
′‑
TGGTTCTGGATTAGCTGGA
‑3′
；检测探针NP2：5
′
荧光基团
‑
CAAC+A+T+CACCTGCT
‑3′
猝灭基团；封阻探针NB2：5
′‑
CGCTTTTCCCAACACCACCTGCT
‑3′
phosphorylation；针对3号外显子上的Codon61突变Q61K的引物和探针的序列为：正向引物NF3：5
′‑
AAACCTGTTTGTTGGACAT
‑3′
；反向引物NR3：5
′‑
ATTGGTCTCTCATGGCACT
‑3′
；检测探针NP3：5
′
荧光基团
‑
CTCTTCT+T+T+TCCAGC
‑3′
猝灭基团；封阻探针NB3：5
′‑
CTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGT
‑3′
phOsphOrylation；针对3号外显子上的Codon61突变Q61R的引物和探针的序列为：正向引物NF4：5
′
荧光基团
‑
CTCTTCTCGTCCAG
‑3′
猝灭基团；...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，张京红，赵哲浩，张媛媛，徐刚伟，谭凯妮，姚湾，林曜华，
申请(专利权)人：湖南圣洲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：