一种UGT1A7参与赫赛汀耐药的乳腺癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种UGT1A7参与赫赛汀耐药的乳腺癌药物中的应用，UGT1A7可以在细胞上起到逆转HER

【技术实现步骤摘要】
一种UGT1A7参与赫赛汀耐药的乳腺癌药物中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及过表达UGT1A7制备逆转HER
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2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀耐药的用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)最新发布了2020年全球最新癌症负担数据，其中全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，成为全球第一大癌。在所有的乳腺癌亚型中，HER
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2阳性的患者占20
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30％，这部分患者预后较差。赫赛汀是针对HER
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2编码的受体酪氨酸激酶胞外段的人源化单克隆抗体，是目前临床上最常用于治疗HER
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2阳性乳腺癌患者的药物。虽然赫赛汀提高了HER
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2阳性乳腺癌患者的生存，但是超过70％的患者治疗后1年内出现耐药。因此，赫赛汀的耐药问题成为影响HER
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2阳性晚期乳腺癌患者治疗疗果和生存时间的重要瓶颈。
[0003]目前已经进行了多项关于赫赛汀耐药机制的研究，大多围绕耐药后信号通路的激活以及EGFR家族受体结构上的改变开展，为了延缓赫赛汀的耐药，目前临床已经有针对耐药机制研发的药物，如针对HER
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2的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类拉帕替尼、吡咯替尼、来那替尼，阻滞HER
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2/HER
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3异源二聚体形成的帕妥珠单抗，这些药物与赫赛汀联合，可提高赫赛汀的疗效，但患者最终仍会出现耐药，导致病情进展。现有的研究只能部分阐明EGFR家族相关的信号通路激活可能仅代表赫赛汀耐药的冰山一角，但是在逆转耐药的新方法方向的研究较少，因此如何逆转或者延缓赫赛汀耐药可以大大延长HER
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2阳性乳腺癌患者的生存时间，节约患者的治疗费用，具有重要的临床意义和社会效益。
[0004]BT474是最常见的HER2阳性乳腺癌细胞株，我们选择BT474为研究对象，构建曲妥珠单抗耐药细胞株BT474HR，为了进一步探讨曲妥珠单抗耐药新机制，进行表达谱芯片检测，结合生物学信息学分析及筛选，发现葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)家族成员UGT1A7可能与乳腺癌曲妥珠单抗耐药密切相关，UGT1A7基因在两组耐药株中均出现显著下调。
[0005]UGT1A7是UGT1A亚家族的成员,是一种分布于内质网的糖蛋白，既往认为其可通过催化葡萄糖醛酸与各种糖苷配基底物结合、发挥解毒功能；目前有关UGT1A7亚家族在肿瘤领域的研究几乎都集中在分子流行病学方面：即研究其基因多态性与肿瘤发生风险的关系，以及其药物代谢的引起的毒性反应或葡萄糖醛酸化与个体化用药的关系；近来陆续也有一些关于UGT1A家族参与抗癌药物耐药方面的研究，但由于研究的抗癌药物均局限于化学药物，其机制主要涉及UGT1A参与了抗癌药物的葡萄糖醛酸化，降低了药物的毒性作用。然而，曲妥珠单抗作为抗体分子，不存在葡萄糖醛酸化的化学基础，显然该机制无法解释UGT1A7下调如何介导曲妥珠单抗耐药。通过对赫赛汀敏感和耐药的细胞中进行基因检测，专利技术人首次发现了UGT1A7在赫赛汀耐药的细胞中表达降低，通过内质网应激以及促进EMT进程，参与了赫赛汀耐药的过程，为HER
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2阳性患者治疗方案的制定、预后判断以及日后制备逆转乳腺癌患者对赫赛汀耐药的药物提供基础和实验依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是发现UGT1A7参与赫赛汀耐药的新机制，为HER
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2阳性患者药物的选择、预后判断以及制备逆转赫赛汀耐药药物提供依据。
[0007]UGT1A7参与赫赛汀耐药的过程，具体来说：
[0008]我们通过浓度梯度的方法构建了BT474耐赫赛汀的细胞株，发现与敏感的亲本细胞相比，耐赫赛汀的BT474HR细胞中UGT1A7表达明显下调，因此我们在细胞水平发现UGT1A7通过线粒体和内质网应激和促进EMT进程，参与调节赫赛汀的耐药过程。
[0009]一种检测BT474、BT474HR细胞中差异基因表达的方法：将BT474和BT474HR进行microarray分析，并与第三方数据GSE15043分析，发现UGT1A7基因在两组耐药株中均出现显著下调，并进一步在小样本临床样本中验证。
[0010]一种通过CCK8方法检测BT474、BT474/HR以及BT474过表达或shRNA UGT1A7的方法，包括如下步骤：
[0011](1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔4000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul；
[0012](2)培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2：及相对湿度条件下，培养96h；
[0013](3)呈色：培养96h后，每孔加入CCK
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8溶液20ul，37℃，继续孵育4h；
[0014](4)比色：490nm波长处测定光密度值OD，每组3个复孔，重复三次实验。计算生存率。生存率＝实验组OD值/对照组OD值
×
100％；
[0015](5)将BT474HR过表达UGT1A7和BT474shRNA UGT1A7后种在96孔板上，4000个细胞/孔；每组给予不同浓度的赫赛汀处理，给药3天后CCK
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8染色法检测细胞活力，进而计算各自的药物IC50。
[0016]一种检测UGT1A7通过影响线粒体的结果和膜电位调节赫赛汀的敏感性的方法，具体包括如下步骤：
[0017](1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以1
×
106/ml细胞接种于12孔培养板中，每孔体积500ul；(2)培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃，5％CO2：及相对湿度条件下，培养96h；
[0018](3)离心：1000rpm离心10min；
[0019](4)固定：离心后，沿管壁加入1ml 2.5％的戊二醛固定液，4℃冰箱保存；
[0020](5)图像采集：使用透射电子显微镜JEOL JEM
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1010在2uM和500uM标尺下进行图像采集；将BT474 siRNA VECTOR、BT474 siUGT1A7以及BT474HR LV
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OE
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VECTOR和BT474HR LV
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OE
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UGT1A7接种24小时后，加入10ug/ml赫赛汀，72h消化重悬细胞。
[0021]乳腺癌患者中，有20
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30％为HER
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2阳性，这部分患者预后较差。赫赛汀是目前HER
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2靶向治疗的基石，提高了HER
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2阳性乳腺癌患者的生存，但本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UGT1A7参与赫赛汀耐药的乳腺癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，UGT1A7可以在细胞上起到逆转HER
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2阳性乳腺癌细胞株对赫赛汀耐药的作用。3.一种发现UGT1A7参与赫赛汀耐药的过程，其特征在于，通过浓度梯度的方法构建了BT474耐赫赛汀的细胞株，发现与敏感的亲本细胞相比，耐赫赛汀的BT474HR细胞中UGT1A7表达明显下调，在细胞水平发现UGT1A7通过线粒体和内质网应激和促进EMT进程，参与调节赫赛汀的耐药过程。4.一种检测BT474、BT474HR细胞中差异基因表达的方法：将BT474和BT474HR进行microarray分析，并与第三方数据GSE15043分析，发现UGT1A7基因在两组耐药株中均出现显著下调，并进一步在小样本临床样本中验证。5.一种通过CCK8方法检测BT474、BT474/HR以及BT474过表达或shRNA UGT1A7的方法，包括如下步骤：(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔4000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul；(2)培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2：及相对湿度条件下，培养96h；(3)呈色：培养96h后，每孔加入CCK
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8溶液20ul，37℃，继续孵育4h；(4)比色：490nm波长处测定光密度值OD，每组3个复孔，重复三次实验。计...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁渊，娄可心，钱瑜，
申请(专利权)人：江苏省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：